靠这项技术，如何成功判断不同胶质瘤的分级与预后？

　　判定胶质瘤属于哪一级、往后预后怎样，过去基本靠病理切片在显微镜下读染色。鲁特卡教授团队另辟蹊径，借助MALDI-MSI（一种成像质谱技术）给脑组织里的神经节苷脂“画分布地图”，靠着不同糖脂的出现与否，把胶质瘤和髓母细胞瘤各自的分级与类别分辨出来。他们在大鼠脑胶质瘤的颅内同种移植瘤，以及人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物切片上，找出了带有预后含义的神经节苷脂。健康成年啮齿类脑里，GM1和GD1是主打的糖脂类型，可这两类糖脂在两种颅内移植瘤里全都消失了。健康成年脑本没有GM3，它却在大鼠胶质瘤的同种移植瘤里大量出现；结合串联质谱，GM3（d18:1/C24:0）被认定为这类胶质瘤移植瘤里含量最丰的神经节苷脂。反过来，人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物的特征是GM2（d18:0/C18:0）明显高表达。这些结果提示，依托组织的神经节苷脂MALDI-MSI有能力辨别不同的脑肿瘤，并有望成为它们分类与定级的一件临床利器。

一项技术与一类分子

　　神经节苷脂是带有神经酰胺和唾液酸寡糖的糖脂，也叫糖鞘脂，住在细胞膜朝外的那一层（胞外侧小叶），在中枢神经系统里表达得很多。肿瘤细胞周边微环境里，神经节苷脂被摄取或脱落的速度明显加快。GM3和GD3是胚胎期脑部最主要的神经节苷脂；随着脑部发育，这类简单神经节苷脂的表达往下走，而复杂类型（GM1、GD1、GT1）的表达往上走。和胚胎脑相似，简单神经节苷脂（GM3、GD3）也是肿瘤组织表面最常见的神经节苷脂。人胶质瘤里，神经节苷脂的形状和浓度都变了样，跟正常脑灰质、白质对得上：原本的主角GM1、GD1a、GT1b在胶质瘤中大幅减少，取而代之的是GM3和GD3占了上风。人髓母细胞瘤方面，对髓母细胞瘤细胞系的糖鞘脂分析显示，其主要神经节苷脂是GM2、GM3和GD1a。肿瘤组织内，神经节苷脂的生物学功能会被自身结构改变牵动——拿神经母细胞瘤来说，含16:0神经酰胺的短链GD2，免疫抑制活性强过带更长神经酰胺链（24:0或24:1）的GD2，后者在非病变组织里更常见。正是这些表达上的变动，让神经节苷脂被拿来当作部分神经来源肿瘤的诊断与预后分子标志。

　　凭神经节苷脂表达所做的组织学特征来给脑肿瘤分类、分级和判断预后，过去一直被“没法看见特定神经节苷脂种类”这个短板卡住。MALDI-MSI是一门能把组织里多种分子的分布可视化的硬核技术，早被广泛用于各类脂质的成像。具体做法是：冷冻切片先裹上特定MALDI基质，再用激光束扫过组织表面，使分析物电离解吸；分析物离子从切片上脱附，被连续收成质量谱，从而取得分子分布与强度随空间坐标起伏的信息。已有不少报道证实MALDI-MSI适合分析脑组织里外层的神经节苷脂分子种类，可这门MSI技术此前从没被用在脑肿瘤上。研究者先用MALDI-MSI考察大鼠胶质瘤颅内同种移植瘤里的神经节苷脂代谢与分布，再用LC-MS/MS对找出的神经节苷脂做确认；为了验证神经节苷脂MALDI-MSI到底能不能分开不同的脑肿瘤，他们还顺带分析了人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物。

实验里的关键发现

　　研究团队先用MALDI-MSI去看初代成年大老鼠脑内GM1和GD1的表达分布，发现GM1和这类糖脂广泛铺在大脑皮层。

图1，成年大鼠脑GM1与GD1的MALDI-MSI成像，颜色深浅表示离子强度，箭头指出MSI中显示的峰；GD1-sa即GD1-唾液酸

　　GD1在皮层的表达和GM1糖脂的表达叠在一起。对GD1标准品的分析表明，GD1糖脂在MALDI-MSI负反射离子模式里会失去唾液酸基团，生成的GD1衍生物刚好在GM1那个质量上电离。脑内GM1的分布也由霍乱毒素B亚基染色得到印证（图2B），该亚基能结合GM1；CTB染色显示GM1待在皮质下白质，皮层里反而偏弱。于是有理由推测，皮层中MALDI-MSI测到的GM1有一部分来自GD1碎裂。另外，GD1糖脂在皮层里格外充裕，所以把1545和1573m/z处的峰标成GM1/GD1-唾液酸（GM1/GD1-sa）；再调一下离子标尺和强度，还能看见GM1也落在白质里。

图2，大鼠胶质瘤颅内同种移植瘤GM1与GD1的MALDI-MSI。(A)示GM1/GD1-唾液酸（H−）d18:1（m/z1545）和20:1（m/z1573）、GD1[M+Na−2H]d18:1（m/z1874）和20:1（m/z1886）的MSI，颜色表离子强度；(B)示该移植瘤中经CTB与抗NRP1抗体免疫染色显示的GM1和NRP-1分布，圆圈标出移植瘤位置

　　在长有胶质瘤颅内同种移植瘤的大鼠脑区，GM1和GD1糖脂的位置没变（图2A），但这两类糖脂在肿瘤里全都不见了（图2A圆圈处）。大鼠胶质瘤的CTB阴性染色（图2B）跟MALDI-MSI看到的GM1缺失对上了（图2A）。胶质瘤细胞经神经纤毛蛋白-1（NRP-1）免疫组化染成阳性得以识别（图2B）；NRP-1是贴在细胞表面的一类糖蛋白，在胶质瘤、髓母细胞瘤在内的多种肿瘤里高表达。

　　对照大鼠脑，以及长着胶质瘤的同种移植瘤的大鼠脑，还被拿来查GM2和GM3在不在。GM2糖脂在对照和移植脑切片里都没查到，而带着d18:1/C24:0神经酰胺的GM3专一地落在胶质瘤移植区（图3A）。MALDI-MSI与H&E叠加，有力地说明GM3在胶质瘤的同种移植瘤里是独一份的表达（图3B）；同一叠加也把胶质瘤的同种移植瘤中GM1糖脂的缺失凸显出来（图3B）。

图3，大鼠胶质瘤颅内同种移植瘤GM3的MALDI-MSI。(A)示GM3（H−）d18:1/C24:0（m/z1264）和d18:0/C20:1（m/z1208）的MSI，颜色表离子强度；(B)示GM1/GD1-唾液酸（d18:1/C18:0）和GM3（d18:1/C24:0）的分子组织学分布，红框标出胶质瘤移植瘤位置

　　团队用LC-MS/MS把MALDI-MSI的数据坐实。他们从80μm厚的脑冷冻切片上取下了胶质瘤的同种移植瘤和对应的非病变区域，做糖鞘脂提取再走串联质谱。LC-MS/MS验证的结果和MALDI-MSI一致：比起非病变脑组织，胶质瘤的同种移植瘤里神经节苷脂的分布从GM1转向了GM3。胶质瘤里最具代表性的GM3种类是GM3（d18:1/C24:0；m/z1264）；在负离子模式下对m/z290碎片做前体离子扫描，确认了这个质量峰的糖脂身份。此外，把GM1/GM3标准品和胶质瘤的糖鞘脂提取物做质谱比对，验证了该肿瘤中的GM3种类含d18:1/C24:0神经酰胺。

　　接着用同样的办法去看人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物。先查看初代成年大老鼠脑里GM1和GD1的表达分布，发现这两种糖脂的分布（图4）跟大鼠脑（图1）对得上；带着人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植瘤的小鼠脑里，这两种糖脂种类的分布也保住了（图5A）。随后用MALDI-MSI查找人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物中GM2和GM3的有无。与胶质瘤的同种移植瘤相反，GM3（d18:1/C24:0）糖脂在髓母细胞瘤的异种移植瘤里没测到（图5A），只看得见内标（IS）。不过MALDI-MSI揭出了一种带d18:0/C18:0神经酰胺的GM2种类（m/z1385；M−H），它专一地定位于髓母细胞瘤的异种移植区（图5）；MALDI-MSI与H&E叠加确认了GM2（d18:0/C18:0）在髓母细胞瘤的异种移植瘤里的表达（图5D）。髓母细胞瘤细胞经NRP-1免疫组化染成阳性得以识别（图5C）。

图4，成年小鼠脑GM1与GD1的MALDI-MSI。(A)示健康成年小鼠脑GM1/GD1-唾液酸（H−）d18:1（m/z1545）和20:1（m/z1573）、GD1[M+Na−2H]d18:1（m/z1874）和20:1[M+K−2H]（m/z1902）的MSI与质谱，箭头标出MSI中显示的峰；(B)示健康成年小鼠脑GM1/GD1-唾液酸与GD1种类分布的重叠

图5，人髓母细胞瘤在小鼠颅内长出的异种移植物中神经节苷脂的MALDI-MSI。(A)示GM1/GD1-唾液酸（H−）d18:1（m/z1545）和20:1（m/z1573）、GD1（[M−H]²⁻）d18:1（m/z1874）和20:1（m/z1902）、GM3（H−）d18:1/C24:0（m/z1264）和GM2（H−）d18:0/C18:0（m/z1385）的MSI，颜色表离子强度；(B)示GM2（d18:0/C18:0）的质谱；(C)示抗NRP1抗体免疫染色显示的神经纤毛蛋白-1分布，插图为肿瘤区40×放大；(D)示GM2（d18:0/C18:0）的分子组织学分布，方框标出髓母细胞瘤移植物的位置

这项研究说明了什么？

　　研究团队借MALDI-MSI分别展示了健康成年啮齿类脑，以及大鼠胶质瘤、人髓母细胞瘤颅内同种与异种移植瘤里各类神经节苷脂的表达与分布。健康成年啮齿类脑的主打神经节苷脂是GM1和GD1；GD1在MALDI-MSI负反射离子模式里会丢唾液酸基团，这种时候会被当成GM1种类测出来。在大鼠与小鼠脑内看到的GM1、GD1糖脂分布相近，加上CTB对GM1的白质染色，都支持“皮层里的GM1信号有一部分来自GD1糖脂”这个看法。

　　已有不少研究讲过脑肿瘤里神经节苷脂表达异常，以及它在肿瘤长出、推进和用药反应里起的作用。通过MALDI-MSI，团队把GM3锁定为大鼠胶质瘤的同种移植瘤里的主要神经节苷脂种类。GM3在神经节苷脂里结构最精简，也是更复杂种类（含GD3、GM2、GD2）的合成前体。GM3在人小脑21至25孕周（细胞增殖正旺时）强表达；到27周其表达明显走弱，出生满两个月时脑里几乎就抓不到GM3了。GM3在肿瘤组织里过表达，是肿瘤细胞里出现频率最高的一类糖脂，它的价值主要落在肿瘤细胞凋亡与耐药这两条线上被探讨。

　　脑肿瘤里的神经节苷脂谱，已有研究证实跟肿瘤的组织病理学来源、恶性程度、侵袭性与进展挂钩。在这项研究里，神经节苷脂MALDI-MSI筛查能分开两类脑肿瘤：它靠GM2的表达认出髓母细胞瘤的异种移植瘤，而胶质瘤的同种移植瘤表达的是GM3；MALDI-MSI在髓母细胞瘤的异种移植瘤里没认出任何GM3种类。原位细胞和培养细胞表达模式不同，极可能GM3在Daoy来源的原位髓母细胞瘤里不表达；或者GM3浓度低于MALDI-MSI的检测下限，又或者辐照区域太小。研究指出，MALDI-MSI读到的分析物多少，会随着空间分辨率平方升高而变少。通常GM2在大多数组织里是配角神经节苷脂，却在部分带Daoy细胞系的癌细胞中高表达。由于能用的组织量有限，团队没能用LC-MS/MS在原位髓母细胞瘤的异种移植瘤里确认GM2种类的身份；不过他们观察到的GM2是颅内髓母细胞瘤的异种移植瘤里主要神经节苷脂当中的一员，和既往发现吻合。

　　分子成像是一门能对那些卷入癌细胞构造与机能紊乱的分子（比如神经节苷脂）做组织学层面研究的技术。这项研究给出的证据显示，MALDI-MSI能辨明不同脑肿瘤各自带有的神经节苷脂分子种类。往后，质谱成像或许能进入脑肿瘤的日常临床鉴别。

常见问题

问：MALDI-MSI到底是什么技术，跟普通病理比好在哪儿？

答：它用激光把组织切片上的分子解吸成离子，直接“拍”出每种分子在空间上的分布图，不用像传统病理那样靠染色后肉眼判断。鲁特卡团队用它看神经节苷脂，正好补足普通切片“看不见特定糖脂种类”的短板。

问：靠神经节苷脂就能分清胶质瘤和髓母细胞瘤吗？

答：研究里能。大鼠胶质瘤的同种移植瘤主打GM3，人髓母细胞瘤的异种移植瘤主打GM2，两者在MALDI-MSI下表达谱明显不同，据此可以把两类肿瘤分开，也为分级提供参考。

问：这项结果现在能直接用于临床诊断吗？

答：还早。目前证据来自大鼠和小鼠的移植瘤模型，原文也写明未来才可能用进脑肿瘤的日常临床鉴别。它更像一个有望落地的分类、定级辅助工具，而非当下可用的确诊手段。

问：GM3和GM2分别是什么，为什么被盯上？

答：两者都属神经节苷脂，是一类带着神经酰胺与唾液酸寡糖的糖脂。GM3在神经节苷脂里结构最精简，也是更复杂种类的合成前体，在肿瘤里常过表达；GM2在某些癌细胞（如Daoy髓母细胞瘤）里高表达，因此被当作区分肿瘤的标志。

问：对胶质瘤患者意味着什么，会影响治疗选择吗？

答：短期看不影响现有治疗决策。它的价值在于给病理医生多一把“尺子”——将来若常规化，或能帮助更精细地定级与判断预后，让分型更客观。