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【INC国际大咖研究成果】U251细胞迁移和侵袭中瞬时受体电位褪黑素7信号通路涉及钙调神经磷酸酶

发布时间:2025-03-26 11:36:14 | 关键词:U251细胞迁移和侵袭中瞬时受体电位褪黑素7信号通路涉及钙调神经磷酸酶

  INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Transient receptor potential melastatin 7 signaling in U251 cell migration and invasion involves calcineurin》(U251细胞迁移和侵袭中瞬时受体电位褪黑素7信号通路涉及钙调神经磷酸酶),以下是研究简述。

  01. 摘要

  瞬时受体电位褪黑素7(TRPM7)是一种二价阳离子通道,在胶质母细胞瘤(GBM)中发挥着关键作用。GBM是成人中最常见且最致命的原发性脑肿瘤。既往研究显示,改变TRPM7的活性会影响GBM细胞的功能,包括细胞的迁移、侵袭和增殖。因此,阐明GBM中TRPM7介导的信号通路可能会揭示新的治疗靶点。钙调神经磷酸酶是一种钙依赖性磷酸酶,同样影响GBM细胞的存活和迁移。然而,TRPM7与钙调神经磷酸酶在GBM信号传导中的作用或关系尚未被研究。在这项研究中,我们提供了证据,表明在GBM细胞系U251中,TRPM7与钙调神经磷酸酶之间可能存在相互作用。此外,我们采用药理学方法证明,TRPM7调节钙调神经磷酸酶的功能,这表明在U251细胞的迁移和侵袭中,钙调神经磷酸酶是TRPM7信号传导的潜在下游靶点。

  02. 研究结果

  (1)带有Flag标签的TRPM7从HEK293和U251细胞裂解液中免疫沉淀出钙调神经磷酸酶A亚基。

图 1:在HEK293和U251细胞中,Flag-TRPM7免疫沉淀钙调神经磷酸酶A亚基。通过免疫印迹法分析了来自(A)HEK293细胞裂解液和(B)U251细胞裂解液的Flag-TRPM7相关蛋白复合物。在共免疫沉淀(co-IP)和输入(HEK293或U251细胞总裂解液)泳道中均检测到TRPM7(212 kDa)和钙调神经磷酸酶A(61 kDa),而在阴性对照泳道(未使用抗Flag抗体进行共免疫沉淀的结果)中均未出现。缩写:TRPM7:瞬时受体电位黑素瘤7。

  图 1:在HEK293和U251细胞中,Flag-TRPM7免疫沉淀钙调神经磷酸酶A亚基。通过免疫印迹法分析了来自(A)HEK293细胞裂解液和(B)U251细胞裂解液的Flag-TRPM7相关蛋白复合物。在共免疫沉淀(co-IP)和输入(HEK293或U251细胞总裂解液)泳道中均检测到TRPM7(212 kDa)和钙调神经磷酸酶A(61 kDa),而在阴性对照泳道(未使用抗Flag抗体进行共免疫沉淀的结果)中均未出现。缩写:TRPM7:瞬时受体电位黑素瘤7.

  (2)钙调蛋白在TRPM7与钙调神经磷酸酶的相互作用中并不发挥中介作用。

钙调蛋白在TRPM7与钙调神经磷酸酶的相互作用中并不发挥中介作用。

  图2:在U251细胞裂解液中,组氨酸标记的钙调蛋白可沉淀钙调神经磷酸酶A,但不沉淀TRPM7.将纯化的6×组氨酸标记的钙调蛋白加入U251细胞总裂解液中。在缺乏Ca2+的情况下,蛋白复合物被沉淀并用西方印迹法分析。阳性对照组包含U251细胞裂解液和组氨酸标记的钙调蛋白。作为阴性对照,也进行了不加组氨酸标记的钙调蛋白的沉淀实验。在沉淀的洗脱样品中检测到钙调神经磷酸酶A(61 kDa)和组氨酸标记的钙调蛋白(20 kDa),而TRPM7通道蛋白(212 kDa)仅存在于上清液中。缩写:TRPM7:瞬时受体电位黑素瘤7.

  (3)抑制钙调神经磷酸酶可增加TRPM7蛋白的表达。

图3:钙调神经磷酸酶抑制增加TRPM7蛋白和mRNA水平。(A)用载体(DMSO;对照)或CsA(10、20、40或80 µM)处理U251细胞24小时后进行CCK-8实验(n = 10/组)。分析采用单因素方差分析(**p < 0.01)。(B–D)细胞在RNA或蛋白提取前24小时用载体(DMSO;对照)或10 µM CsA处理。(B)西方印迹带的代表性图像和(C)以GAPDH为对照的曝光强度,使用ImageJ处理,并用t检验进行统计分析(*p < 0.05;n = 8或9/组)。(D)使用qRT-PCR检测TRPM7 mRNA水平,并以GAPDH为参考基因。用t检验分析对照组和处理组之间的差异(***p < 0.001;n = 6/组)。缩写:TRPM7:瞬时受体电位黑素瘤7;CsA:环孢素A。

  图3:钙调神经磷酸酶抑制增加TRPM7蛋白和mRNA水平。(A)用载体(DMSO;对照)或CsA(10、20、40或80 µM)处理U251细胞24小时后进行CCK-8实验(n = 10/组)。分析采用单因素方差分析(**p < 0.01)。(B–D)细胞在RNA或蛋白提取前24小时用载体(DMSO;对照)或10 µM CsA处理。(B)西方印迹带的代表性图像和(C)以GAPDH为对照的曝光强度,使用ImageJ处理,并用t检验进行统计分析(*p < 0.05;n = 8或9/组)。(D)使用qRT-PCR检测TRPM7 mRNA水平,并以GAPDH为参考基因。用t检验分析对照组和处理组之间的差异(***p < 0.001;n = 6/组)。缩写:TRPM7:瞬时受体电位黑素瘤7;CsA:环孢素A。

  (4)使用TRPM7激活剂并不能逆转钙调神经磷酸酶抑制对U251细胞迁移和侵袭的影响。

图4:CsA和naltriben联合治疗对U251细胞迁移和侵袭的抑制作用与单独使用CsA治疗相似。细胞用DMSO载体、CsA和/或naltriben(分别为10和25 µM)处理。(A)伤口愈合实验。在划痕后0和24小时拍摄图像,并使用ImageJ勾勒伤口大小。(B)采用单因素方差分析和事后图基检验比较各组伤口闭合百分比(*p < 0.05;与25 µM naltriben组相比:#### p < 0.0001;与10 µM CsA组相比:ns,无显著差异;n = 7/组)。比较10 µM CsA组与对照组时,发现有显著的中度减少(p < 0.05)。(C)奥里斯迁移实验。在伤口形成后0、12、24和48小时拍摄图像,并使用ImageJ勾勒伤口大小。(D)采用单因素方差分析和事后图基检验比较各组伤口闭合百分比(*p < 0.05;**p < 0.01;与25 µM naltriben组相比:#### p < 0.0001;与10 µM CsA组相比:ns,无显著差异;n = 7/组)。(E)马特里格尔侵袭实验。采用单因素方差分析和事后图基检验评估统计学意义(ns,无显著差异;**p < 0.01.与对照组相比;#### p < 0.0001.与25 µM naltriben组相比;n = 3/组)。比较10 µM CsA组与对照组时,发现有中度减少的趋势(p = 0.131)。缩写:CsA:环孢素A;ANOVA:方差分析。

  图4:CsA和naltriben联合治疗对U251细胞迁移和侵袭的抑制作用与单独使用CsA治疗相似。细胞用DMSO载体、CsA和/或naltriben(分别为10和25 µM)处理。(A)伤口愈合实验。在划痕后0和24小时拍摄图像,并使用ImageJ勾勒伤口大小。(B)采用单因素方差分析和事后图基检验比较各组伤口闭合百分比(*p < 0.05;与25 µM naltriben组相比:#### p < 0.0001;与10 µM CsA组相比:ns,无显著差异;n = 7/组)。比较10 µM CsA组与对照组时,发现有显著的中度减少(p < 0.05)。(C)奥里斯迁移实验。在伤口形成后0、12、24和48小时拍摄图像,并使用ImageJ勾勒伤口大小。(D)采用单因素方差分析和事后图基检验比较各组伤口闭合百分比(*p < 0.05;**p < 0.01;与25 µM naltriben组相比:#### p < 0.0001;与10 µM CsA组相比:ns,无显著差异;n = 7/组)。(E)马特里格尔侵袭实验。采用单因素方差分析和事后图基检验评估统计学意义(ns,无显著差异;**p < 0.01.与对照组相比;#### p < 0.0001.与25 µM naltriben组相比;n = 3/组)。比较10 µM CsA组与对照组时,发现有中度减少的趋势(p = 0.131)。缩写:CsA:环孢素A;ANOVA:方差分析。

  (5)环孢素A(CsA)诱导的PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的变化不受纳尔曲苯(naltriben)的影响。

CsA和naltriben联合治疗对AKT和ERK磷酸化水平的影响与单独使用CsA治疗相似。细胞在蛋白收集进行西方印迹前24小时用载体、CsA和/或naltriben(分别为10或25 µM)处理。使用ImageJ分析光密度。(A)代表性图像和(B、C)p-AKT和t-AKT水平的统计分析。采用单因素方差分析和事后图基检验评估显著差异(**p < 0.01.与对照组相比;#### p < 0.0001.与25 µM naltriben组相比;n = 7/组)。(D)代表性图像和(E、F)p-ERK和t-ERK水平的统计分析。采用单因素方差分析和事后图基检验评估统计学意义(各组间无显著差异;n = 4/组)。需要注意的是,尽管与对照组相比,10 µM CsA组和联合治疗组有降低的趋势,但我们并未观察到显著性(p > 0.05)。缩写:CsA:环孢素A;ANOVA:方差分析。

  图5:CsA和naltriben联合治疗对AKT和ERK磷酸化水平的影响与单独使用CsA治疗相似。细胞在蛋白收集进行西方印迹前24小时用载体、CsA和/或naltriben(分别为10或25 µM)处理。使用ImageJ分析光密度。(A)代表性图像和(B、C)p-AKT和t-AKT水平的统计分析。采用单因素方差分析和事后图基检验评估显著差异(**p < 0.01.与对照组相比;#### p < 0.0001.与25 µM naltriben组相比;n = 7/组)。(D)代表性图像和(E、F)p-ERK和t-ERK水平的统计分析。采用单因素方差分析和事后图基检验评估统计学意义(各组间无显著差异;n = 4/组)。需要注意的是,尽管与对照组相比,10 µM CsA组和联合治疗组有降低的趋势,但我们并未观察到显著性(p > 0.05)。缩写:CsA:环孢素A;ANOVA:方差分析。

使用 Biorender 创建的图形摘要。

  图6:使用 Biorender 创建的图形摘要。

  03. 结论

  现有的研究结果表明,瞬时受体电位褪黑素7(TRPM7)通道与钙调神经磷酸酶A亚基蛋白之间存在相互作用,这种相互作用可能是直接的,也可能是间接的。异常的TRPM7活性可以通过多种途径增强胶质母细胞瘤(GBM)细胞的功能,而钙调神经磷酸酶可能是其潜在的下游靶点之一(图6)。在本研究中,我们采用了一种GBM细胞系(即U251)来阐明这一机制。需要注意的是,目前在U251细胞系中获得的研究结果可能并不能完全反映TRPM7在胶质瘤干细胞中介导的信号传导特性。未来的研究应考虑使用其他GBM细胞系以及胶质瘤干细胞来进一步验证TRPM7与钙调神经磷酸酶之间的相互作用。通过在TRPM7介导的信号通路中识别潜在的药物靶点,我们的最终目标是推动新型化疗药物的研发,为GBM的治疗提供新的手段。

Rutka教授

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