【INC国际大咖研究成果】基于脂质组学的方法，利用皮秒红外激光质谱技术在10秒内对主要的儿童脑瘤类型进行分类

　　INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Lipidomic-Based Approach to 10 s Classiffcation of Major Pediatric Brain Cancer Types with Picosecond Infrared Laser Mass Spectrometry》(基于脂质组学的方法，利用皮秒红外激光质谱技术在10秒内对主要的儿童脑瘤类型进行分类)，以下是研究简述。

　　01. 摘要

　　通过回顾性患者组织研究，皮秒红外激光质谱(PIRLMS)显示能够区分髓母细胞瘤与毛细胞型星形细胞瘤及两种室管膜瘤亚型(PF-EPN-A、ST-EPN-RELA)。在10秒的采样和分析时间内，利用激光提取的脂质进行PIRL-MS分析。以基因组学数据为标准，这种分类方法的平均敏感性和特异性分别为96.41%和99.54%，并且使用了许多在10秒PIRL-MS光谱中可解析的分子特征。液相色谱与高分辨率串联质谱(LC-MS/MS)进一步分析，使我们能够将分子特征列表缩减至仅18种与分类相关的代谢脂质标志物。这些代谢标志物包括磷脂酸、脂肪酸、神经酰胺及磷脂酰胆碱/乙醇胺等，可在95%的预测概率阈值下，分别以94.39%和98.78%的平均敏感性和特异性进行分类。因此，利用已知代谢生物标志物，神经外科医生现在可以通过10秒的PIRL-MS分析，快速准确地对选定的儿科脑癌类型进行病理分类。通过回顾性挖掘“生存”与“切除范围”数据，我们进一步确定了可能从10秒PIRL-MS病理反馈中获益的儿科癌症类型。在这些情况下，可以优化手术切除的激进程度，以期使患者的总体生存率或无进展生存率受益。PIRL-MS有望成为推动手术室个性化决策的工具。

　　图1. 主要儿科脑癌类型的代表性10秒PIRL-MS光谱。图中展示了室管膜瘤(EPN)(PF-EPN-A、ST-EPN-RELA)、毛细胞型星形细胞瘤(PA)和髓母细胞瘤(MB，例如第4组亚组)的PIRL-MS光谱，这些光谱具有独特的质谱区分特征。负责这些癌症类型10秒分类的质荷比(m/z)值(本研究中确定了它们的分子身份，见表1)用黑色字体标注。红色字体的m/z值代表在所检查的质量范围内存在的丰富离子。我们还列出了每个质谱的总离子计数，这表明在所提出的实验条件下，可以从这些标本中获得高质量的质谱。MB数据此前已发表6.此处重新展示是为了讨论的清晰性，并确保新分析的EPN和PA标本不会被误分类为MB。

　　02. 研究方法

　　此前分析并发表的髓母细胞瘤(MB)标本通过NanoString和甲基化分析进行亚组分类。本研究主要使用NanoString方法对MB亚组进行分类。NanoString方法尤其适用于WNT和SHH亚组的准确分类，并且除了少数重叠病例外，也适用于清晰区分3组和4组。鉴于甲基化分析与NanoString之间的不一致程度相对较低，在少数情况下使用甲基化分析数据。室管膜瘤和毛细胞型星形细胞瘤(PA)标本在PIRL-MS采样后通过苏木精-伊红(H&E)评估进行注释。RELA融合状态通过多伦多病童医院(SickKids)的甲基化分析获得。

　　在加拿大多伦多的病童医院(SickKids)开展的“神经系统肿瘤组织库的形成”研究中，收集了患者材料。该研究在获得书面知情同意(包括发表数据的同意)后进行，并在SickKids研究伦理审查委员会的批准和监督下开展。这些冷冻的儿科脑癌标本在获得机构授权(UHN 17-5298和SickKids 1000057113)后从SickKids库中获取。标本按照危险货物运输(TDG)指南的要求在干冰上运输，并在生物安全柜内分析前在室温下解冻。

　　表1. 通过色谱分析、高分辨率质谱和串联质谱确定的用于高灵敏度和高特异性分类儿科脑癌的代谢物阵列的分子身份

　　在本表中，我们展示了通过精确质量、MS2模式和同位素比值分析(基于LipidMaps在线工具中的匹配结果，详见实验部分)从图S4的加载图分析中确认的18种代谢脂质的分子身份。我们包含了观测质量和理论质量、离子形式、诊断碎片、建议的分配以及与理论质量的偏差(以ppm为单位)，这些信息与之前的研究一致。对于仅通过精确质量比较得出的初步分配，我们已明确标注。需要注意的是，对于m/z 792.74.PC(38:5)的碎片显示出PC(16:0/22:5)和PC(18:1/20:4)的混合物。

　　图2. 基于表1中18种已鉴定代谢物的稀疏PCA-LDA模型。该模型采用稀疏(或低复杂度)的PCA-LDA建模方法(使用AMX6.18)，与图S2中使用m/z 100−1000范围内所有m/z特征不同，此处仅利用表1中完全鉴定的代谢物阵列。在此，多变量模型仅基于表1中确定并报告的18种特征的分子身份进行同步降维构建。我们展示了模型的两个视图(围绕LD3轴，蓝色轴旋转)。LD1和LD2轴分别以红色和绿色显示。

　　表2：使用特征代谢物阵列进行盲样品预测的灵敏度和特异性计算

　　在这里，我们采用了图2中的稀疏低复杂度PCA-LDA模型，该模型使用表1中的18种代谢物来计算儿科癌症类型预测的敏感性和特异性。我们使用了与图S2模型(该模型使用整个m/z 100−1000范围内的未鉴定光谱特征)相同的未知样本进行预测。表S4的注释为读者提供了关于盲样分类、报告以及敏感性和特异性值计算的必要细节。

　　在此，我们展示了在两个马氏距离预测置信区间下，以及仅考虑预测概率大于95%的正向匹配情况下的原始数据敏感性和特异性计算结果(详见表S7)。为了实现这种“概率阈值”，我们将预测概率小于95%的分类(在表S7中划线标注)从敏感性和特异性的计算中排除。

　　平均敏感性值在无95%置信阈值和有95%置信阈值的情况下分别为：75.00%、88.24%、93.10%、100%(平均为89.08%)，以及77.55%、100%、100%、100%(平均为94.39%)。相应的平均特异性值计算如下：97.27%、95.13%、97.60%、100%(平均为97.50%)，以及100%、96.22%、98.88%、100%(平均为98.77%)。

　　图3. 使用PIRL-MS对主要儿科脑癌进行监督式两步分类的协议。通过结合本文的研究成果与我们之前的工作，我们提出了一种用于在10秒内对7种儿科脑癌进行分类的监督式两步协议。该方法使用两个包含4个组件的PCA-LDA模型，部署在引用的质量范围内，以提供高于94%的敏感性和特异性，用于儿科脑癌类型的分类。第一个模型仅使用18种代谢物的特征列表，这些代谢物的特征已经明确;第二个模型则深入探讨髓母细胞瘤的分子亚组，将使用大量m/z特征，其中一些目前尚未明确。

　　03. 研究结论

　　在这项研究中，我们展示了使用PIRL-MS技术在10秒内对常见儿科脑癌类型进行分类。尽管本研究仅使用了156个冷冻标本(其中113例为髓母细胞瘤，之前已发表)，但将最后40%的标本纳入研究并未提高基于图S7中学习曲线所示的图S2中4组件PCA-LDA模型的预测敏感性和特异性。这一观察结果表明，所使用的分子模型很可能是稳健的(尽管仅使用了数十例室管膜瘤和毛细胞型星形细胞瘤标本)，并且必须在更大规模的前瞻性新鲜组织研究(包括罕见癌症)中进一步验证，以严格评估其临床实用性。在这里，小鼠研究已表明大脑组织的新鲜和冷冻组织特征之间存在一致性。

　　此外，尽管在10秒内客观区分髓母细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤和室管膜瘤的优势与当前术中组织病理学染色和显微镜检查(约30分钟，是目前的术中标准)相比仍需讨论，但本研究中以90%、100%(ST-EPN-RELA)和95.65%、100%(基于表S4结果)的敏感性和特异性将室管膜瘤分子亚型区分为ST-EPN-RELA和PF-EPN-A队列必须强调。总体而言，我们认为这里展示的初步研究，结合之前发表的髓母细胞瘤亚组分类(目前无法通过常规冷冻切片分析实现)，在成熟后，可能根据表S9中总结的情景，使手术室中的个性化决策成为可能，以确定切除范围。这些假设基于对“生存”与“切除范围”数据的回顾性分析，必须通过临床试验的患者结果进一步验证。