【INC国际前沿研究】激酶组药物筛选揭示多靶点酪氨酸激酶抑制剂协同作用及ATRT靶向治疗策略

　　James T. Rutka鲁特卡教授曾任世界神经外科学院院长，现任世界神经外科知名期刊《Journal of Neurosurgery》主编。30余年来深耕儿童神经外科研究，带领团队在脑瘤分子分型、精准治疗、新药研发及微创治疗领域持续突破，为全球神经外科疑难病患儿带来希望。其发表的研究《A kinome drug screen identifies multi-TKI synergies and ERBB2 signaling as a therapeutic vulnerability in MYC/TYR subgroup atypical teratoid rhabdoid tumors》（激酶组药物筛选揭示多靶点酪氨酸激酶抑制剂协同作用及ERBB2信号靶向治疗MYC/TYR亚组非典型畸胎样/横纹肌样瘤的新策略），以下是研究概述。

01PART研究背景

　　非典型畸胎样/横纹肌样瘤（ATRT）是一种罕见且预后极差的儿童恶性脑肿瘤。最新研究已将其分为3个分子亚组（SHH、TYR、MYC），各亚组疾病模式与信号特征存在显著差异，但针对各亚组的有效治疗策略尚未明确。

02PART研究亮点

　　首次阐明MYC/TYR亚组ATRT的有效联合治疗方案。

　　在前临床模型中证实阿法替尼（Afatinib）靶向ERBB2可显著延长生存期。

03PART研究意义

　　通过评估包含临床级激酶抑制剂的定制库，本研究明确了ATRT各分子亚组的信号依赖性。发现了MYC/TYR亚组ATRT的联合治疗靶点，揭示其依赖ERBB2表达及新型表观遗传调控机制。最终，在前临床小鼠模型中证实阿法替尼靶向ERBB2可延长生存期。综上，本研究揭示了ATRT亚组的关键可靶向信号依赖，为临床应用提供了直接的抑制剂选择依据。

04PART研究方法

　　利用465种激酶抑制剂对按分子亚组分型（SHH、TYR、MYC）的ATRT细胞系进行功能性筛选，并结合多组学分析（转录组、表观基因组）探讨抑制剂效应的分子机制。

05PART研究结果

　　ATRT细胞系普遍对靶向PI3K/MAPK通路抑制剂、CDK抑制剂、AURKA/B抑制剂及PLK1抑制剂敏感。研究鉴定出两类主要靶向受体酪氨酸激酶（PDGFR与EGFR/ERBB2）的多靶点酪氨酸激酶抑制剂（Multi-TKI），在MYC/TYR亚组中活性显著。PDGFRB抑制剂达沙替尼（Dasatinib）与广谱PI3K/MAPK通路抑制剂（雷帕霉素/Rapamycin、曲美替尼/Trametinib）联用时，对MYC/TYR亚组ATRT细胞生长产生协同抑制作用。MYC/TYR亚组ATRT细胞对多种ERBB2信号抑制剂高度敏感。转录组、H3K27Ac ChIP-seq、ATAC-seq及HiChIP分析显示，原发MYC/TYR亚组ATRT中ERBB2表达与差异甲基化及DNA环介导的特异性增强子激活相关。值得注意的是，具有脑渗透性的EGFR/ERBB2抑制剂阿法替尼（Afatinib），在体外和体内均显著抑制MYC/TYR亚组ATRT细胞生长并延长荷瘤动物生存期。

图1 各亚组特异及广谱激酶抑制剂反应：(A) 药物筛选工作流程示意图。(B) 细胞系与肿瘤组织间全转录组相关性的热图。正z分数相关系数表示更高相似度。(C) 对6株ATRT细胞系（CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05、BT-12、CHLA-06、BT-16）测定的药物EC50值进行无监督皮尔森相关层次聚类的热图。(D) 火山图展示SHH亚组细胞系（CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05）与MYC/TYR亚组细胞系（CHLA-06、BT-12、BT-16）间EC50差异的Welch T检验；垂直虚线为1 μM差异阈值，水平虚线为P<0.05阈值。(E) 在各亚组细胞系间EC50均值差异显著的激酶抑制剂列表。(F) 按平均EC50值（低至高）排序的30种广谱激酶抑制剂列表，按共同靶点类别分组。

图2 达沙替尼诱导细胞周期阻滞并与MTOR/MAPK通路抑制剂协同：(A) BT-16细胞经200 nM达沙替尼（D）处理24h及72h后的细胞周期分析（对比DMSO对照/V）。(B) 200 nM达沙替尼（D）处理24h及72h后的Caspase 3/7活性（对比0.1% DMSO/V）。(C) qRT-PCR检测200 nM达沙替尼（D）处理24h后P53、CDKN1A、CDKN2A mRNA相对表达变化（P<0.001，对比DMSO/V）。(D) Western blot检测BT-16细胞经100 nM达沙替尼处理24h及72h后P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2表达（对比DMSO/V）。(E) 达沙替尼与雷帕霉素剂量矩阵联合作用的BRAID协同分析。(F) 达沙替尼与曲美替尼剂量矩阵联合作用的BRAID协同分析。

图3 ERBB2在MYC/TYR型ATRT中上调表达、亚型特异性存在且为细胞存活必需：(A) qRT-PCR检测ATRT细胞系ErbB家族成员表达（人胎脑额叶/FB-FL为参照）。(B) HT12基因表达芯片检测60例原发ATRT中ERBB2的亚组特异性表达。(C) Western blot检测ATRT细胞系ERBB2与EGFR表达；*SHH亚组细胞系（CHLA-02、CHLA-04、CHLA-05）未检出ERBB2蛋白。(D) siRNA敲低ERBB2 96h后，Western blot检测ATRT细胞系ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2及微管蛋白表达。(E-H) ERBB2 siRNA与Scramble对照（Scr）处理MYC/TYR细胞系后的增殖曲线（Alamar Blue法）：(E)BT-16, (F)CHLA-06, (G)BT-12, (H)CHLA-266。(I-J) 19例ATRT亚组（RNA-Seq）中ERBB2长转录本（NM_001005862）(I)与短转录本（NM_004448）(J)的表达。

图4 MYC/TYR ATRT中ERBB2短转录本相关增强子元件呈现差异甲基化与染色质构象：(A) RefSeq基因注释（chr17:37 760 000--37 940 000）参照下，展示SHH、TYR、MYC原发ATRT中ERBB2（粉色）位点的ATAC-seq与H3K27Ac ChIP-seq结果，标注预测的ERBB2及FANTOM5增强子轨迹。放大视图显示与ERBB2短转录本相关的增强子元件EnhE及其与重叠基因GRB7（蓝色）的相对位置。TYR/MYC ATRT中EnhE的开放区域、H3K27Ac峰、甲基化探针及转录因子结合域（chr17:37 892 000--37 900 000）一并展示。EnhE内相对低甲基化探针在MYC/TYR ATRT中以红色标注（P<0.05）。(B) IGV轨迹展示基于H3K27Ac HiChIP的ERBB2位点环化关系。弧线代表环，y轴为支持相互作用的读对数。显著接触（FDR<0.05）以彩色显示，淡色为非显著环。匹配的H3K27Ac ChIP-seq富集峰同步展示，峰高对应读数。ERBB2启动子远端区域以高H3K27Ac水平标记。

图5 MYC/TYR细胞系对EGFR/ERBB2抑制剂高度敏感：(A-F) ATRT细胞系接受临床可用EGFR/ERBB2抑制剂的剂量-反应曲线：(A)达克替尼/Dacomitinib, (B)AEE-788, (C)吉非替尼/Gefitinib, (D)阿法替尼/Afatinib, (E)拉帕替尼/Lapatinib, (F)厄洛替尼/Erlotinib。(G) AlamarBlue荧光法检测BT-16、CHLA-06细胞在递增浓度阿法替尼处理3天后的活力。(H) BT-16、CHLA-06细胞经100 nM阿法替尼处理24h后的Caspase 3/7活性（对比0.1% DMSO）。(I) BT-16、CHLA-06细胞经100 nM阿法替尼处理24h后的细胞周期分析（对比DMSO）。(J) CHLA-16（注：原文此处似为BT-16之误）、CHLA-06细胞经梯度浓度阿法替尼（0.0001--1 µM）处理后，Western blot检测P-ERBB2(Tyr 1221/1222)、ERBB2、P-AKT(Thr308)、AKT、P-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、ERK1/2及微管蛋白表达。

图6 ERBB2/EGFR抑制剂阿法替尼延长ATRT原位小鼠模型生存期：(A) 携带BT-16异种移植物的NSG小鼠接受每日25 mg/kg阿法替尼灌胃14天的Kaplan-Meier生存曲线：对照组中位生存47天，阿法替尼组56天（P<0.001）。(B) BT-16异种移植物NSG小鼠（冠状面）对照组与阿法替尼组（25 mg/kg）的H&E染色。(C) 免疫组化检测AKT Thr308磷酸化（P-AKT-Thr308），下方为光密度定量：对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。(D) Ki-67免疫组化染色，下方为阳性细胞/总细胞比值：对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。(E) 裂解型Caspase 3免疫组化染色，下方为阳性细胞/总细胞比值：对照组 (n=9) vs 阿法替尼组 (25 mg/kg, n=9)。

06PART研究结论

　　本研究提出联合靶向PDGFR与ERBB2的酪氨酸激酶抑制剂及PI3K/MAPK通路抑制剂，作为MYC/TYR亚组ATRT的新治疗策略。

07PART关于作者

国际儿童神经外科专家 James T. Rutka鲁特卡教授

　　James T. Rutka鲁特卡教授是世界神经外科联合会（WFNS）执行委员会及顾问委员会成员，发表学术论文超过500篇。临床研究方向聚焦颅内肿瘤，在胶质瘤、纤维瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤诊疗方面拥有丰富经验。擅长清醒开颅术、显微手术以及国际前沿技术激光间质热疗（LITT），后者广泛应用于恶性脑瘤及癫痫治疗。针对儿童胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤开展了多项临床试验。其所在的加拿大多伦多病童医院（SickKids）是国际知名儿童医院之一。