儿童低级别胶质瘤，做甲基化检测到底有没有用？

　　儿童低级别胶质瘤（PLGG）属儿童中枢神经系统肿瘤中最常见的一类，可分布于全神经轴，肿瘤所处位置不同往往对应不同预后。PLGG整体预后偏向良好，但目前仍难以可靠预判哪些肿瘤最易复发或恶变。

　　若可实现全切除，PLGG患儿长期生存率可观；而未完全切除的PLGG后续管理则较为复杂，常需辅以放疗与化疗。值得注意的是，因PLGG的治疗决策并不完全依赖病理亚型，部分肿瘤未行活检，治疗多基于病史与影像学发现采取经验性方案——为这类患者确定更精准的治疗路径，仍需更科学的决策依据。

　　基于多项分子分析结果，PLGG中已发现多种遗传改变，且这些改变汇聚于Ras/丝裂原活化蛋白激酶通路。PLGG中最常见改变为KIAA1549-BRAF融合，其次为神经纤维瘤病1型（NF1）的种系与体细胞突变，以及BRAF p.V600E突变。

　　DNA甲基化对应的表观遗传学手段，可用于理解、诊断并对儿童脑肿瘤做风险分层。表观基因组分析已揭示若干新分子实体，能更精准地对肿瘤分类，如胚胎性脑肿瘤；亦能对髓母细胞瘤、室管膜瘤等做亚分类，且该亚分类可识别其中的预后风险组，部分患者可据此调整治疗。

　　那么，单纯依靠DNA甲基化检测，能否实现儿童低级别胶质瘤的精准分类？INC国际神经外科医生集团旗下世界神经外科顾问团（WANG）成员、国际小儿神经外科专家James T. Rutka（鲁特卡）教授团队开展了一项长达30年的临床随访研究，通过全面分子数据（基因突变检测、全基因组甲基化）分析，得出几项关键发现：

（1）经甲基化分析得出的亚组，主要并非由肿瘤本身决定，即并非单纯反映肿瘤细胞的分子本质。

（2）在PLGG中，单独行甲基化分类常不可靠，或可引发不明确乃至错误结果。

（3）联合遗传学（分子检测）、表观遗传学（DNA甲基化）与病理检测，可识别罕见PLGG组别，对肿瘤行预后分层，并针对高风险肿瘤实施精准治疗，此项组合才具真实价值。

01 Rutka教授团队的3项关键研究发现

　　教授团队对152例H3F3A野生型PLGG完成了完整分子分析，结合形态学及临床结局做综合判断，其中136例来自病童医院（SickKids），16例为来自圣裘德儿童研究医院的BRAF p.V600E突变型PLGG（表1）。

关键发现一：PLGG甲基化分组受关键细胞与分子因素驱动

　　对152例PLGG的全基因组甲基化数据行层次聚类（图1A），PLGG可被划分为3个主簇，其中簇2与簇3各自含2个附加子簇——上述分组反映了肿瘤位置及额外的细胞与分子事件。

　　簇1主要涵盖源自小脑及下丘脑-视路的PLGG；簇3含半球肿瘤，可再细分为簇3A与簇3B两组。对上述肿瘤的影像学分析显示，附着于中线的肿瘤在簇3A中富集，而簇3B则富集于位置更偏外周的半球肿瘤（图1B）。

　　肿瘤位置较任一分子或形态学特征更能决定簇的归属。

　　簇2含两个不同亚组，分子与非肿瘤因素在其中均发挥关键作用。簇2A统一纳入伴BRAF p.V600E突变与CDKN2A纯合缺失的半球肿瘤；上述簇2A的PLGG均属海德堡分类器判定的PXA样肿瘤。簇2B则富集LUMP评分偏低的肿瘤——LUMP评分系根据甲基化数据计算的标本中白细胞/淋巴细胞浸润替代标志物，提示簇2B中的肿瘤受高白细胞/淋巴细胞浸润影响（图1A）。

　　因簇2B提示这些PLGG存在免疫浸润，团队进一步对该组内特定肿瘤做了研究。LUMP评分偏低的BRAF p.V600E突变型肿瘤，其无进展生存期显著更差（图2A、B）；低LUMP评分与上述肿瘤中的其他临床及分子变量无关（表2a）。有趣的是，LUMP评分在BRAF野生型肿瘤中无预后意义。

　　为验证LUMP评分是否准确反映白细胞/淋巴细胞浸润，研究回溯了具LUMP评分数据的BRAF p.V600E突变型PLGG（n=45）的病理切片，在低LUMP评分的肿瘤中确证了淋巴细胞浸润。此外依据病理学评估，高淋巴细胞浸润的BRAF p.V600E突变型PLGG，其无进展生存期较无浸润者更差（图2C），多变量分析中接近显著性（表2b）。上述数据提示，高淋巴细胞浸润或为BRAF p.V600E突变型PLGG中一项重要预后因素。

关键发现二：PLGG中甲基化检测的局限

　　为评估基于甲基化的分类在PLGG中的临床作用，研究将现有基于甲基化的分子分类器应用于来自不同机构的全部肿瘤（图3）。该分类器在SickKids队列中51%的病例（69/136例）、St Jude队列中34%的病例（29/86例）未能达到校准评分>0.9的高置信度——该指标反映诊断可靠性。这与英国基于人群队列中67%（57/85例）的病例表现相当（图3A）。无任何一例经病理诊断为PLGG的肿瘤被分类器更改为高级别胶质瘤。

　　BRAF p.V600E突变与BRAF融合在多个甲基化亚类中均有分布（图3A）。部分罕见改变（如FGFR1-TACC1、FGFR2融合、MYBL1改变、ALK融合）在分类器内聚集。10.9%的PLGG被分类器归为"非肿瘤组织"，包括反应性炎症与对照正常脑组织——上述主要为低置信度肿瘤，具备PLGG的临床、影像学及病理诊断，且全部肿瘤均携带PLGG中常见的分子改变（如BRAF p.V600E或BRAF融合）。

关键发现三：联合甲基化、病理学与分子分析重定义PXA样肿瘤

　　甲基化分析的可行优势之一，在于可将伴BRAF p.V600E突变/CDKN2A缺失的肿瘤划分为独立临床实体，即PXA样胶质瘤。研究共27例PXA样肿瘤被分类器以高置信度识别，含17例低级别（13例PXA、2例神经节细胞胶质瘤、1例促纤维增生性婴儿神经节细胞胶质瘤、1例低级别星形细胞瘤〈未另行指定〉）与10例高级别组织学（5例间变性PXA、3例胶质母细胞瘤、1例间变性星形细胞瘤、1例间变性神经节细胞胶质瘤）。除3例外，所有病例同时具BRAF V600E突变与CDKN2A纯合缺失。

　　全队列5年总生存率为82%。

　　上述肿瘤可依病理分级划分为两组：PXA样PLGG的结局显著优于PXA样高级别胶质瘤；5年时所有PXA样PLGG均存活，而高级别肿瘤中仅34%存活（图3B）。

　　研究亦检测了全部BRAF p.V600E突变/CDKN2A纯合缺失的肿瘤（含20例低级别：14例PXA、3例神经节细胞胶质瘤、2例低级别星形细胞瘤、1例促纤维增生性婴儿神经节细胞胶质瘤；12例高级别：5例胶质母细胞瘤、4例间变性PXA、1例间变性星形细胞瘤、1例间变性神经节细胞胶质瘤、1例胶质肉瘤）。上述肿瘤多数被分类器归为"PXA"。虽病理分级决定了该队列的生存率（图3C），但在同时具两种遗传改变的病例中，"PXA样"与"非PXA样"之间无预后差异（图3D）。

02 研究结论：联合病理、分子与甲基化检测的价值

　　这项针对PLGG的较大规模队列研究，结合长期结局数据与形态学、分子及表观遗传学状态，重新界定了甲基化作为这类脑瘤临床与生物学工具的作用。研究提供了肿瘤位置及其他非肿瘤变量在PLGG中作用的证据，描述了全基因组甲基化数据在PLGG组别临床分类与预后分层中的潜力与局限。

　　无监督聚类通常为肿瘤分析中浮现新亚组及其生物学作用提供概览的第一步。尽管视路与小脑肿瘤聚为一类，但团队观察到大脑半球内特定位置具不同谱型，或对应不同起源细胞，这一点具参考价值。因簇3A代表位置更中心的肿瘤、携带类似改变，识别该子簇未来或具临床与生物学价值。全切除在BRAF p.V600E突变型PLGG中极为关键，而在簇3A肿瘤中全切难度偏高，因此靶向不同起源细胞或可作为这类肿瘤管理与未来方案的重要组成部分。

　　簇2B为PLGG提供了一个此前未被充分认识的视角。数据显示，LUMP评分与淋巴细胞浸润相关，且可能与肿瘤进展相关。PLGG中可发生淋巴细胞浸润，尤以神经节细胞胶质瘤、PXA及毛细胞型星形细胞瘤为著；具高慢性炎症浸润的病例无进展生存期更差——淋巴细胞浸润或为BRAF p.V600E突变型PLGG复发的标志物。

　　研究另一重要临床维度是重新界定甲基化在PLGG中的潜力与陷阱。在PLGG中，单靠甲基化聚类在达到高置信度判定方面存在明显问题，且在定义临床相关亚组方面不如其他肿瘤有用——此点与多数儿童脑肿瘤（尤其胚胎性、高级别肿瘤）差异显著。

　　与多数儿童胚胎性及高级别肿瘤相比，PLGG活检中的细胞群构成多样，含多种正常及反应性细胞，可使基于甲基化的诊断产生偏移。尽管部分浸润性活检中混合的正常神经元与胶质细胞或使起源细胞分析复杂化，但基于甲基化、指示高免疫细胞浸润的LUMP评分，可作为肿瘤预后与靶向治疗的工具。

　　在诸多肿瘤（如后颅窝室管膜瘤及其他胚胎性肿瘤）中，无特定遗传改变可支撑亚组划分；但数据提示几乎所有PLGG均可发现独特的、通常为互斥的驱动突变，这有助肿瘤分层并确定对应治疗。靶向治疗时代，此类遗传分层的作用将持续抬升，并可能掩盖表观遗传学分析在PLGG中的作用。

　　甲基化在多种肿瘤类型中识别新罕见亚组的独特能力——即揭示这些肿瘤中的遗传改变——在PLGG中同样显现益处，例如海德堡分类器似为诊断DLGNT的最优工具。

　　研究团队建议：在PLGG管理中，或需联合组织病理学、分子与表观遗传学（甲基化检测）三类方法；而在多数PLGG中，组织病理学联合遗传学分析已足以完成初步分类；当分子工具无法确定诊断时，甲基化可为正确分层提供重要补充。后续研究将有助于验证表观遗传学分析在靶向PLGG起源细胞及微环境中的作用。