【INC国际大咖研究成果】斜坡脊索瘤异种移植模型的构建与鉴定揭示肿瘤基因组不稳定性特征-国际神经外科医生集团

　　INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《Characterization of a Clival Chordoma Xenograft Model Reveals Tumor Genomic Instability》(少突胶质细胞病与局灶性皮质发育不良I型的磁共振成像、脑磁图及手术结果比较)，以下是研究简述。

　　01. 摘要

　　患者源性异种移植模型(PDX)较培养中的肿瘤细胞更能保留亲代肿瘤的遗传特征。既往报道的两种斜坡脊索瘤异种移植模型均源自放疗后复发的肿瘤。为研究未接受放疗暴露的斜坡脊索瘤遗传学特征，我们在原发性切除术中建立了患者源性异种移植模型。通过手术收集的斜坡脊索瘤组织进行颅骨外板移植，在非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)中成功建立肿瘤生长，并连续传代七代。再生肿瘤显示出典型的囊泡状细胞结构，免疫组化染色对Brachyury、细胞角蛋白和S100蛋白呈阳性反应，且具有骨质侵犯特征。

　　单核苷酸多态性分析显示，与亲代肿瘤相比，异种移植肿瘤中观察到T基因(Brachyury)的拷贝扩数增及细胞周期依赖性激酶抑制因子2A(CDKN2A)的杂合性缺失。尽管肿瘤抑制基因脆性组氨酸三联体(FHIT)存在杂合性缺失，但FHIT蛋白表达得以保留。连续三代传代过程中观察到拷贝数缺失和扩增的累积以及肿瘤生长速率的加快。

　　该患者源性异种移植模型成功复现了斜坡脊索瘤的表型特征。未来该模型可用于深入研究脊索瘤的生物学行为，并作为评估新型治疗方法的实验平台。

　　02. 材料与方法

　　肿瘤采集与初始植入

　　经患者知情同意后，依据圣迈克尔医院伦理委员会批准的方案采集肿瘤组织用于研究。患者为一名68岁男性，主诉颈部疼痛及舌肌无力持续1年。术前颅底磁共振成像(MRI)及计算机断层扫描(CT)显示，下斜坡中央区存在占位性病变，向下延伸至C2椎体水平，未发现转移性病变。影像学检查显示病灶呈异质性强化，T1加权像呈低信号，T2加权像呈高信号，并伴有骨质侵蚀(图1)。

　　在术中导航引导下，采用经鼻-经蝶内镜手术切除肿瘤。在确保获取足够组织用于病理诊断后，将数块肿瘤组织包裹于无菌纱布中，置于部分注满生理盐水的标本容器内以保持组织湿润。会诊病理学家通过免疫组化分析确认诊断为经典型脊索瘤(未另作分类)。肿瘤组织显示整合酶相互作用因子1(Integrase Interactor 1)及p53表达阳性。术后患者病情迅速进展。

　　图1 原发性斜坡脊索瘤的影像学特征

　　A: 轴位T1加权磁共振成像(MRI)显示斜坡中线区占位性病变(T)。

　　B: T1加权钆增强MRI显示肿瘤(T)呈异质强化性。

　　C: 轴位T2加权MRI显示下斜坡区高信号微囊性硬膜外肿瘤(T)。

　　D: 轴位平扫计算机断层扫描(CT)显示斜坡骨质侵蚀(箭头)。

　　03. 讨论

　　近年来，针对脊索瘤(一种对标准化疗高度耐药的肿瘤)新型治疗药物的研究模型的建立引起了广泛关注。

　　本研究报道了一种未接受过放疗的患者源性斜坡脊索瘤在非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)中的生长及连续传代情况。这是文献中报道的第三个患者源性斜坡脊索瘤模型，但却是首个源自未放疗肿瘤的模型。该模型的优势在于其保留了肿瘤形成所需的起始突变。小鼠中肿瘤的初始生长较为缓慢，耗时超过3个月。然而，随着起始细胞数量的增加，肿瘤在植入后15天即可触及。肿瘤的缓慢生长随后进入快速扩张期，最终导致各代小鼠死亡，这一过程与人类临床病程相似。异种移植瘤的细胞学特征与原发肿瘤一致，即由圆形核的囊泡状细胞构成，周围环绕结缔组织基质(图5E)。异种移植瘤内的结缔组织源自宿主小鼠细胞。因此，囊泡状细胞能够引导支持性基质的形成。这一发现意义重大，因为该模型可用于研究肿瘤微环境的变化以抑制肿瘤生长。异种移植瘤细胞侵入骨质，与人类脊索瘤的表现一致。原发肿瘤的术前影像学检查显示斜坡呈内生性(Ⅰ型)破坏(图1)。近期研究显示，与外生性(Ⅱ型)斜坡脊索瘤相比，具有这种生长模式的斜坡脊索瘤与细胞运动性和侵袭性蛋白的差异表达相关。本异种移植斜坡脊索瘤模型可用于进一步研究导致观察到的肿瘤细胞学特征的细胞相互作用、肿瘤微环境中的信号传导过程以及骨质侵袭机制。在肿瘤原生环境中进行研究可避免二维细胞培养系统中可能出现的基质蛋白表达和细胞行为改变。

　　该未放疗的建立的肿瘤异种移植模型对于评估放疗后的基因组和蛋白质组变化以及研究放疗增敏剂的效果也将是有用的。在遗传水平上，初始异种移植瘤(PDX0)及其第三代(PDX3)与亲代肿瘤相比显示出拷贝数变化，表明该斜坡脊索瘤模型的基因组不稳定性。随着PDX代数的增加，肿瘤生长加快，PDX4的Ki67指数较亲代肿瘤有所增加。在本研究报道的斜坡脊索瘤PDX模型和一个骶骨脊索瘤细胞系(MUG-Chor1)中，6号染色体涉及T基因位点的区域拷贝数扩增得以保留，这一发现尤为显著，因为该区域在我们的模型中连续三代以及在MUG-Chor1细胞系的多次传代中均得以保留。通过RNAscope分析发现，从PDX0到PDX3代，T基因拷贝数有增加的趋势。这些观察结果支持T基因表达在脊索瘤维持中的重要性。既往研究表明，Brachyury表达对于脊索瘤细胞系的维持至关重要。此外，T基因拷贝数的增加可能促进了异种移植模型后期代的增殖，因为拷贝数增加与磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的激活相关。

　　对本文所述的患者源性脊索瘤异种移植模型进行的单核苷酸多态性分析显示，与脊索瘤细胞系和肿瘤的SNP数据观察结果相似的拷贝数扩增和缺失模式。既往研究显示，在一组脊柱和骶骨脊索瘤中，CDKN2A的杂合性缺失发生率为58%，纯合性缺失为12%。在本模型中，CDKN2A表现为杂合性缺失，但作为广泛9号染色体杂合性缺失的一部分。包括CDKN2A位点的9p缺失发生在18例中的4例(22%)斜坡脊索瘤中。同样，FHIT的杂合性缺失作为染色体...

　　FHIT编码一种在多种癌症中丢失的肿瘤抑制蛋白。在67%的斜坡脊索瘤和98%的骶骨脊索瘤中，FHIT蛋白表达降低或缺失。在因吸烟暴露导致的肺部癌前病变中观察到FHIT基因的单等位基因缺失。在缺乏一个FHIT基因等位基因的小鼠中，78%在给予单一剂量的致癌物N-亚硝基苯甲胺后发展为前胃肿瘤，且在21个月后平均每只小鼠自发形成0.94个肿瘤。因此，单次打击事件(如单等位FHIT缺失)可能足以触发脊索瘤的发生。尽管在已建立的异种移植模型中观察到FHIT蛋白表达，但蛋白功能可能因FHIT基因转录本的改变而改变(在宫颈癌中报告了FHIT基因转录本的改变)。肿瘤细胞中FHIT的显著表达表明该蛋白在这些细胞的细胞生物学中具有重要作用，类似于在肾集合管细胞中的表达。值得注意的是，不仅脊索细胞，而且形成中间中胚层并随后形成肾集合管的胚胎细胞均显示Brachyury表达。

　　本研究未探讨FHIT等位基因mRNA转录本的改变;因此，该模型中是否存在功能性FHIT蛋白这一问题目前尚无答案。观察到从亲代到第三代肿瘤的大规模和小规模基因组改变，包括染色体不平衡以及全基因组拷贝数扩增和缺失的增加。本研究首次显示，随着异种移植肿瘤的多代生长，脊索瘤中存在染色体基因组不稳定性。尚不确定拷贝数变化的累积是否是所有脊索瘤细胞的固有特征，还是由于选择性偏差导致更可能适应非人类细胞外环境的肿瘤细胞(因DNA修复机制的缺失)。然而，至少一部分脊索瘤细胞显示出拷贝数变化的累积，这可能解释了该肿瘤对放疗和化疗的耐药性。已知基因组不稳定性使其他肿瘤(如黑色素瘤和结直肠癌)对化疗产生耐药性。

　　04. 研究结论

　　我们成功建立了一种源自未接受放疗的斜坡脊索瘤的患者源性异种移植模型(PDX)，该模型可在免疫缺陷小鼠中连续传代，并稳定形成与脊索瘤细胞学及免疫组化特征一致的肿瘤病灶。随着传代次数的增加，肿瘤基因组拷贝数的扩增和缺失呈累积性变化，提示染色体不稳定性可能在脊索瘤的进展及化疗耐药性中发挥重要的生物学作用。

　　图2.苏木精-伊红染色显示脊索瘤异种移植瘤(箭头)侵入小鼠颅骨。比例尺为50毫米。

图3 A: 异种移植瘤植入后各代小鼠的肿瘤生长曲线。图中比较了第四代（PDX4）和第七代（PDX7）小鼠的肿瘤生长情况，显示PDX7的肿瘤形成时间更早。B: 原发肿瘤、PDX4及PDX7的组织学切片，显示Ki67免疫组化染色结果。图中量化了原发肿瘤、PDX4及PDX7的Ki67指数，结果显示PDX7的Ki67指数显著高于原发肿瘤（P < 0.01）。比例尺为50毫米。

　　图3 A: 异种移植瘤植入后各代小鼠的肿瘤生长曲线。图中比较了第四代(PDX4)和第七代(PDX7)小鼠的肿瘤生长情况，显示PDX7的肿瘤形成时间更早。

　　B: 原发肿瘤、PDX4及PDX7的组织学切片，显示Ki67免疫组化染色结果。图中量化了原发肿瘤、PDX4及PDX7的Ki67指数，结果显示PDX7的Ki67指数显著高于原发肿瘤(P < 0.01)。比例尺为50毫米。

图4原发肿瘤及第三代异种移植瘤（PDX3）的组织学切片显示免疫组化染色对广谱细胞角蛋白（Pan-CK）和核Brachyury呈阳性反应，且上皮膜抗原（EMA）缺失。苏木精-伊红（H&E）染色显示肿瘤细胞学特征，即囊泡状细胞形成的团块周围环绕一层纺锤形细胞，这一特征在异种移植瘤中得以保留。比例尺为40毫米。

　　图4原发肿瘤及第三代异种移植瘤(PDX3)的组织学切片显示免疫组化染色对广谱细胞角蛋白(Pan-CK)和核Brachyury呈阳性反应，且上皮膜抗原(EMA)缺失。苏木精-伊红(H&E)染色显示肿瘤细胞学特征，即囊泡状细胞形成的团块周围环绕一层纺锤形细胞，这一特征在异种移植瘤中得以保留。比例尺为40毫米。

图5A: 亲代脊索瘤的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。B: 第三代异种移植瘤的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。囊泡状肿瘤细胞（箭头）显示显著的免疫标记，而相邻的小鼠结缔组织（箭头）未见标记。C: U87人胶质母细胞瘤异种移植模型（阴性对照）的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。D: 人肾组织（阳性对照）的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。E: 第八代异种移植瘤的组织学切片，经抗人核抗体免疫标记，识别囊泡状肿瘤细胞为人源性，而相关结缔组织（箭头）源自小鼠。F: 小鼠骨骼肌（阴性对照）的组织学切片，经抗人核抗体免疫标记。比例尺为20毫米。

　　图5A: 亲代脊索瘤的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。B: 第三代异种移植瘤的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。囊泡状肿瘤细胞(箭头)显示显著的免疫标记，而相邻的小鼠结缔组织(箭头)未见标记。C: U87人胶质母细胞瘤异种移植模型(阴性对照)的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。D: 人肾组织(阳性对照)的组织学切片，经抗人FHIT抗体免疫标记。E: 第八代异种移植瘤的组织学切片，经抗人核抗体免疫标记，识别囊泡状肿瘤细胞为人源性，而相关结缔组织(箭头)源自小鼠。F: 小鼠骨骼肌(阴性对照)的组织学切片，经抗人核抗体免疫标记。比例尺为20毫米。

图6 A: 亲代肿瘤（O）、原始异种移植瘤（PDX0）及第三代异种移植瘤（PDX3）的染色体拷贝数缺失（蓝色）和扩增（红色）图谱。B: 染色体图显示6号染色体某区段的拷贝数扩增，该区段包含T基因。C: 针对T基因的探针进行的RNAscope分析。每个斑点表示单个RNA分子。通过Definiens XD 2.6版的自定义算法对每核斑点数量进行计数。核和斑点经分割和轮廓描绘。PDX3的T基因标记水平显著高于PDX0（P < 0.001），表明该基因的拷贝数扩增。比例尺为10毫米。Chr6，6号染色体。

　　图6 A: 亲代肿瘤(O)、原始异种移植瘤(PDX0)及第三代异种移植瘤(PDX3)的染色体拷贝数缺失(蓝色)和扩增(红色)图谱。B: 染色体图显示6号染色体某区段的拷贝数扩增，该区段包含T基因。C: 针对T基因的探针进行的RNAscope分析。每个斑点表示单个RNA分子。通过Definiens XD 2.6版的自定义算法对每核斑点数量进行计数。核和斑点经分割和轮廓描绘。PDX3的T基因标记水平显著高于PDX0(P < 0.001)，表明该基因的拷贝数扩增。比例尺为10毫米。Chr6.6号染色体。

Rutka教授