【INC国际大咖研究成果】ADAR2编辑活性通过调控CDC14B/Skp2/p21/p27轴抑制胶质母细胞瘤生长

​　　INC国际儿童脑瘤专家、世界小儿神经系统专业杂志《Child's Nervous System》现任主编Concezio Di Rocco教授发表研究论文《ADAR2-editing activity inhibits glioblastoma growth through the modulation of the CDC14B/Skp2/p21/p27 axis》（ADAR2编辑活性通过调控CDC14B/Skp2/p21/p27轴抑制胶质母细胞瘤生长），以下是研究主要内容概述。

01 研究摘要

　　IV级星形细胞瘤（多形性胶质母细胞瘤，GBM）属人类最具侵袭性及致死性的肿瘤类型之一。ADAR2介导的A→I RNA编辑是脑组织必需的转录后修饰过程，但在GBM及星形细胞瘤细胞系中显著受损，其功能尚未明确。本研究证实，在星形细胞瘤中恢复ADAR2编辑活性可阻止体内肿瘤生长，并调控GBM中常失调的Skp2/p21/p27细胞周期通路。ADAR2脱氨酶活性为抑制肿瘤生长所必需。研究首次发现磷酸酶CDC14B是该通路的上游关键新型ADAR2靶基因：ADAR2对CDC14B前体mRNA的编辑提高其表达水平，进而降低Skp2蛋白水平，该机制在体外与体内模型均获验证。与正常脑组织相比，CDC14B的编辑率和表达水平从I级至IV级星形细胞瘤逐渐下降，在GBM中几乎缺失。

　　综上结论包括：（1）A→I RNA编辑对GBM发病机制至关重要；（2）ADAR2编辑酶是新型候选抑癌基因；（3）ADAR2或其底物可作为更安全、有效的GBM治疗新靶点。

02 研究结果

​​图1 ADAR2编辑活性通过调控细胞周期影响星形细胞瘤细胞增殖​​

(a) U118亲本细胞、ADAR2过表达细胞及酶失活突变体ADAR2E/A细胞的总蛋白免疫印迹检测ADAR2表达；(b) 以β-肌动蛋白作为内参，相对蛋白表达量以任意单位表示，以内源水平设为1；(c) 5×10^4 U118细胞增殖曲线：未处理（浅灰）、空载体（深灰）、ADAR2（红）及ADAR2E/A（黑）第1-4天结果。误差条表示5次独立实验标准差（Mean ± s.d., n=5），P < 0.05、​​P < 0.01 vs ADAR2E/A；(d) 5×10^4细胞BrdU/PI双标记流式周期分析（FACSCanto II）：ADAR2（红）与ADAR2E/A（黑）接种后24-48h示例（Mean ± s.d., n=3），P < 0.05、​**​P < 0.01；采用Click-iT EDU试剂盒获得一致结果；(e) 5×10^4细胞第1-4天凋亡检测：ADAR2（红）与ADAR2E/A（黑）（Mean ± s.d., n=3）。

​​图2 ADAR2编辑活性抑制星形细胞瘤体内生长​​

(a) 2.5×10^6 U118亲本、空载体、ADAR2及ADAR2E/A细胞肿瘤生长曲线。肿瘤体积以首次测量值（设为1）的倍数表示（y轴），x轴为注射后天数（Mean ± s.d., n=20），​​P < 0.01 vs ADAR2E/A肿瘤；(b) 上述各组小鼠的Kaplan-Meier累积生存曲线；(c) 注射后15天（指数生长期）取瘤行免疫组织化学：左图示代表性视野，分别进行抗-GFP、抗-Ki67及TUNEL染色（箭头示凋亡细胞）；右图示U118未处理（浅灰）、空载体（深灰）、ADAR2（红）及ADAR2E/A（黑）肿瘤中GFP、Ki67、TUNEL阳性细胞百分比（Mean ± s.d., n=10），​​P < 0.01。

​​图3 ADAR2表达对p27/p21/Skp2通路的体内外分析​​

(a) 空载体、ADAR2及ADAR2E/A细胞总蛋白的p27、p21、Skp2免疫印迹；(b) 15天移植瘤免疫组化：ADAR2与ADAR2E/A肿瘤代表性视野（p27、p21、Skp2染色）；(c) 移植瘤（15天）IHC阳性细胞百分比：未处理U118（浅灰）、空载体（深灰）、ADAR2（红）、ADAR2 E/A（黑）（Mean ± s.d., n=10），​**​P < 0.01；(d) qRT-PCR检测上述细胞系p27、p21、Skp2 mRNA水平（Mean ± s.d., n=4）；(e) 空载体、ADAR2、ADAR2E/A细胞总蛋白的CDK4、CDK2、Cyclin D1、Cyclin E免疫印迹。

​​图4 ADAR2介导的RNA编辑在体内外调控CDC14B表达​​

(a) U118基因组DNA（gDNA）、U118亲本cDNA及U118-ADAR2 cDNA中CDC14B内含子7-8区域测序色谱图。编辑位点（1-4I、13I）呈A（绿）与G（黑）双峰，右侧标注编辑率；(b) 半定量RT-PCR检测CDC14B前体mRNA与成熟mRNA：ADAR2 vs ADAR2-E/A，表达量以ADAR2-E/A设为1的相对倍数表示，β-肌动蛋白内参；(c) qRT-PCR检测CDC14B mRNA：空载体、ADAR2、ADAR2-E/A细胞（Mean ± s.d., n=3），*P < 0.01；(d) 免疫印迹检测CDC14B蛋白（左）及光密度定量（右）；(e) ADAR2与ADAR2-E/A移植瘤CDC14B免疫组化代表性视野。

​​图5 ADAR2编辑上调CDC14B表达并调控细胞增殖​​

(a) ADAR2-U118细胞及其scramble（scr）或siADAR2稳定转染株的总蛋白ADAR2免疫印迹；(b) 内源性CDC14B转录本测序图，箭头示随机位点编辑率；(c) qRT-PCR检测CDC14B mRNA：ADAR2、scrADAR2、siADAR2组（Mean ± s.d., n=2），​​P < 0.01；(d) 增殖曲线：未处理U118、ADAR2、scrADAR2、siADAR2（Mean ± s.d., n=3），P < 0.05、​​P < 0.01 vs siADAR2；(e) A172细胞沉默内源ADAR2后24、48、72小时的ADAR2与CDC14B qRT-PCR（Mean ± s.d., n=2），P < 0.05、​​P < 0.01 vs scrADAR2；(f) A172 scramble与ADAR2沉默株增殖曲线（Mean ± s.d., n=2），​​P < 0.01。

​​图6 ADAR2介导的CDC14B表达对星形细胞瘤细胞增殖的重要性​​

(a) U118细胞转染CDC14B-flag或失活突变体C314S-CDC14B-flag后48、72小时的Skp2蛋白Western blot；(b) 对应增殖曲线（Mean ± s.d., n=2），P < 0.05；(c)(d) U87细胞重复(a)(b)实验（Mean ± s.d., n=2），P < 0.05，​​P < 0.01；(e) "沉默-再表达"策略示意图：ADAR2-U118细胞先稳定沉默内源CDC14B（0小时），24小时后（内源降低约90%）等量转染CDC14B-flag（红）或C314S-CDC14B-flag（黑）；(f) 增殖曲线：沉默内源CDC14B的ADAR2-U118（灰）及再转染CDC14B-flag（红）或C314S-CDC14B-flag（黑）组，以未处理ADAR2-U118（蓝）为对照（Mean ± s.d., n=2），​​P < 0.01（72、96小时C314S vs CDC14B-flag），*P < 0.05（ADAR2-U118 vs 两组突变/再表达）；(g) 上述再表达实验中72、96小时的Skp2蛋白Western blot。

​​图7 CDC14B转录本在星形细胞瘤与正常脑组织中的编辑率与表达水平​​

(a) CDC14B内含子7-8 Alu区域13个编辑位点（1-13I）的编辑百分比：正常脑组织（黑，n=3）、I级（深灰，n=7）与IV级星形细胞瘤（浅灰，n=12）；(b) 代表性测序色谱：白质对照（Ctrl）gDNA（上）及cDNA、I级与IV级肿瘤cDNA；箭头示编辑位点及百分比；(c) CDC14B mRNA qRT-PCR：正常脑、I级与IV级肿瘤（Mean ± s.d., n=3），P < 0.05，​*​P < 0.01；(d) CDC14B免疫组化：IV级、I级肿瘤与正常脑（Ctrl）；内皮细胞为内参阳性对照（右下）；(e) 各组织CDC14B编辑水平与mRNA表达相关性：正常（黑点）、I级（深灰点）、IV级（浅灰点）标本；示显著相关示例，采用Spearman非参数检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

​​图8 ADAR2在星形细胞瘤细胞增殖中的作用模式图​​

ADAR2通过（直接和/或间接）促进CDC14B RNA编辑及过表达，驱动CDC14B蛋白升高；CDC14B诱导Skp2降解，进而上调p21与p27，使细胞周期阻滞于G1期，从而抑制增殖。

03 关于作者

　　小儿神经外科专注于解决儿童诸多神经外科疾病，包括脑肿瘤、脑积水、小儿癫痫、先天畸形等，一直被视为难度最大的外科专业之一。Concezio Di Rocco教授曾接受法国、埃及、吉尔吉斯斯坦等国家的邀请进行讲座和现场演示，并联合全球知名小儿神经外科专家创办儿童神经外科研究所课程。该课程在过去30年间为世界培养了大量儿童神经外科医生，目前国内多家知名三甲医院的儿童神经外科主任专家均曾师从于他。Di Rocco教授将领先治疗技术分享给世界各地儿科神经外科医生参考学习，为世界儿科神经外科发展做出重大贡献。教授曾到访苏州大学附属儿童医院，为6名神经外科疑难杂症孤儿提供义诊。

​​Di Rocco教授学术任职与成就​​：

国际儿童神经外科学会（ISPN）主席（1991-1994年）

世界神经外科联合会（WFNS）教育委员会共同主席（2013-2017年）

世界神经外科联合会儿童神经外科委员会主席（2001-2009年）

世界小儿神经系统知名杂志《Child's Nervous System》现任主编

国际儿童颅底学会主席（创始成员）

世界神经外科联合会基金小儿脑积水项目负责人

德国汉诺威国际神经科学研究所（INI）儿科神经外科主任（2013年至今）

欧洲神经外科学会（EANS）前副主席

世界神经外科学会联合会（WFNS）儿科委员会前主席

罗马天主教大学医学院儿科神经外科学系主任

　　自2014年5月起，Di Rocco教授担任德国汉诺威国际神经科学研究所（INI）儿科神经外科主任。从事儿童神经外科事业50余年，教授尤其擅长小儿神经纤维瘤、癫痫、脑积水、蛛网膜囊肿、颅缝早闭、脑和脊髓肿瘤、脑和脊柱畸形（半椎体畸形、皮质发育不良、脊髓脊膜膨出、脊髓内脂肪瘤、Arnold-Chiari畸形等）难治性疾病的诊疗，已完成超过12000例神经外科手术。