干细胞治疗胶质母细胞瘤:20年展望

　　胶质母细胞瘤是较致命的原发性脑肿瘤，至今仍是一种无法治愈的疾病。治疗耐药性在很大水平上归因于治疗药物的输送和分配的限制。在过去的20年里，大量的临床前研究已经证明了干细胞作为抗淋巴瘤药物的可行性和合适性，这导致了临床试验的发展，以测试这些疗法。在这篇综述中，我们介绍和分析了这些研究，讨论了其有益效果的潜在机制，并强调了实验进展、局限性和有希望的新治疗途径的出现。我们希望提高对干细胞治疗胶质母细胞瘤的优势的认识，并激发进一步的研究，从而加速合适疗法的实施。

图1。用于治疗胶质母细胞瘤的酶/前药策略的作用机制。

　　治疗性干细胞的开始

　　瑞士神经学家Wilhelm His(1874)。从那时起，这些细胞的存在、特性和潜力就一直吸引着神经科学界。20世纪中期的研究证实它们是大脑中神经元和大胶质细胞的来源。20世纪末，当无数优雅的谱系追踪研究证明某些干细胞能够成为并潜在地补充中枢神经系统中的任何细胞类型时，神经科学家同意将这些细胞命名为“神经干细胞”。对神经干细胞治疗各种神经退行性疾病和中枢神经系统创伤的潜力的认识几乎是瞬间的。早期临床前研究已经证明了神经干细胞在溶酶体贮积病中的潜在用途，亨廷顿氏病，帕金森病，多发性硬化症，肌萎缩性侧索硬化和脊髓损伤。

　　如今，超过40项临床试验正在测试使用神经干细胞治疗多种神经系统疾病，包括胶质母细胞瘤(clinicaltrials.gov).然而，将临床前发现转化为批准的疗法受到了几个障碍的阻碍。其中包括对使用胎儿来源细胞的伦理担忧，以及在使用未经批准的干细胞干预时遇到的不良后果。干细胞疗法的临床试验也因开发批准的“现成”干细胞作为新的研究药物所需的较大成本和努力而放缓，这需要科学家、临床医生、行业、监管机构和资助机构之间建立合适的合作。

　　恶性胶质瘤是较常见的原发性脑肿瘤，2010-2014年发病率为10万分之六。大多数胶质瘤(61.5%)是胶质母细胞瘤(GBM)，这是较具侵袭性的形式，目前尚无治愈方法。自2005年以来，护理标准(SOC)保持相对不变，包括较大顺利肿瘤切除，然后是放疗和化疗。较近，已经证明，在SOC中加入肿瘤治疗场，通过放置在患者头皮上的换能器阵列传递低强度交变电场，将原发性GBM的总生存期从16个月增加到20.9个月。虽然肿瘤治疗领域已被美国食品和药物管理局批准作为新诊断的GBM的辅助治疗，但它们在临床实践中的应用迄今仍然有限。诊断为GBM的患者的平均预期寿命仍然是15-17个月。

　　继SOC之后，肿瘤不可避免地复发并发展为越来越具侵袭性的形式。GBM的复发归因于许多因素:肿瘤的异质性组成，使得它们难以用单一药物靶向；阻碍药物分布的血脑屏障和肿瘤内异常血管化；该疾病的高度侵袭性和浸润性，神经胶质瘤细胞在距离肿瘤体很远的地方穿透脑实质；神经胶质瘤干细胞(GSCs)的存在，也称为脑肿瘤起始细胞或复发起始干细胞。

　　长期以来，人们一直认为国家顺利委员会在性别歧视的源头出了问题，但这一观点从未得到完全证实。然而，有证据表明，至少在部分肿瘤中可能是这样。例如，已证明与脑室下区(SVZ)接触并到达皮层的GBM在较初诊断时更可能是多灶性的和/或在复发时进展为多灶性疾病，表明SVZ的转化细胞(要么是神经干细胞，要么是它们的后代)向外迁移到皮质的机制，类似于皮质发育过程中由放射状胶质细胞引导的神经祖细胞的由内向外迁移。

　　维持端粒长度所需的端粒酶活性是干细胞区室和癌细胞的特征，具有促进细胞存活和增殖的重要功能[30].的启动子中的种系和体细胞突变端粒酶催化亚基基因导致增加端粒酶催化亚基启动子活性，并且经常在许多实体癌中观察到，包括主要在成人中的原发性脑肿瘤[31,32].一项支持神经干细胞可能代表GBM起源细胞的令人信服的研究分析了30例GBM和其他原发性或转移性肿瘤患者肿瘤和无瘤SVZ以及正常脑中存在的突变数量。作者报道，42.3%的患者在的编码区或启动子区至少有一个体细胞突变端粒酶催化亚基肿瘤和无肿瘤的SVZ共享。一些GBM患者(5/16)的无瘤SVZ也含有通常在GBM中发现的驱动突变(在TP53,抑癌基因,肾小球滤过率和RB1)，约为匹配肿瘤的1%。SVZ的突变局限于GFAP+星形胶质细胞样干细胞，表明SVZ神经干细胞和大部分肿瘤细胞之间的谱系关系，支持神经干细胞是GBM起源的假设，至少在一些患者中是这样。端粒酶催化亚基启动子突变是本研究中发现的较常见的突变，也在正常脑组织中发现，尽管频率低于无肿瘤的SVZ。

　　多年来，我们对构成神经干细胞——即能够自我更新并产生分化神经元和神经胶质的细胞——的理解不断发展。在发育过程中，脑室区和SVZ的放射状胶质细胞是生长大脑中全部神经元和大胶质细胞的起源。在成人大脑中，神经源性区域存在于SVZ和海马的颗粒下区域，其中神经干细胞由不同的星形胶质细胞代表:SVZ的B细胞和海马的放射状星形胶质细胞。神经干细胞产生中间祖细胞，中间祖细胞进一步分裂产生神经干细胞和少突胶质前体细胞。NPC也是多能祖细胞，可增殖，但自我更新能力更有限，可分化成至少两种不同的细胞谱系。重要的是，当被培养时在试管内使用神经球测定法，在补充有表皮生长因子和FGF的无血清培养基中，来自一个神经干细胞的神经球是神经干细胞和神经干细胞的异质群体，可产生神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。

　　有趣的是，较近一项使用单细胞RNA测序(scRNA-Seq)从11名患者收集的GBM样本的研究确定了一个具有高侵袭潜力的放射状胶质细胞亚群，该亚群也含有GSC遗传标记，并显示了发育放射状胶质细胞的有丝分裂体细胞易位表型特征。这是否反映了GBMs的潜在来源于癌变过程中重新激活的停滞胚胎组织很难说；尽管如此，这些发现支持了恶性肿瘤利用发育机制来促进生长和侵袭的观点。这项研究，以及其他较近使用强大的scRNA-Seq技术的研究，强调了GBMs的较大异质性和GSC标记的广泛表达。比较富含GSC的原代GBM细胞和人胎脑NPCs的scRNA-Seq信号，Couturier以及其他人。描述了一个保守的神经三线性GBM层级，该层级以胶质祖细胞(较具化学抗性和致瘤性的细胞)为中心，反映了正常脑发育中祖细胞的层级。

　　核动力源的一个决定性特点是它们能够远距离迁移。CXCL12趋化因子及其同源信号受体CXCR4，较初被鉴定为调节造血干细胞运输的稳态趋化因子/受体复合物，激活驱动发育中的中枢神经系统中NPC迁移的主要信号通路之一，并指导GSCs的迁移。CXCL12在SVZ高度表达和骨髓造血干细胞小生境中，在那里它促进原始造血细胞的迁移。肿瘤内CXCL12的产生因缺氧和辐射而增加。在假帕利沙司(世卫组织四级GBM的一个标志性组织学特征)中也发现了高水平的CXCL12，这些区域也含有GSCs。因此，GSCs和NSCs具有共同的迁移行为，这至少部分归因于它们对CXCL12趋化性的反应。

　　移植到大脑中的啮齿类神经干细胞表现出内在的迁移行为，遵循发育途径。人类神经干细胞的行为类似。当从15周大的人类胎儿的脑室周围端脑区产生并通过用v-myc进行逆转录病毒转导而永生化的hNSCs被注射到新生小鼠的侧脑室中时，它们在嘴侧迁移流中加入迁移的内源性小鼠神经母细胞并分化成嗅觉神经元。根据移植部位的不同，植入的神经干细胞也可分化为少突胶质细胞、星形胶质细胞或小脑颗粒细胞，证明了它们的多能性。有趣的是，观察到虽然永生化的神经干细胞增殖良好在试管内，一旦移植到小鼠大脑中，它们的v-myc表达下调，细胞停止分裂。这种行为的潜在原因尚不清楚，但被认为是在分化过程中诱导有丝分裂停滞的正常发育机制的结果。对小鼠永生化神经干细胞进行了类似的观察。

　　考虑到迫切需要找到更好的肿瘤内分布治疗药物的策略，科学家在GBM小鼠模型中测试了永生化的神经干细胞。优雅地证明了当小鼠神经干细胞(来自4日龄小鼠小脑的C17.2细胞v-myc)被注射到肿瘤中或距肿瘤距离处(在对侧半球、脑室内或静脉内)，在全身给药后，它们变得广泛分布于整个肿瘤中，尽管功效较低。神经干细胞也向脑实质深处的侵袭性神经胶质瘤细胞流迁移。当细胞被转导表达一种治疗酶时，这种向肿瘤迁移的行为没有改变，这为神经干细胞有可能在GBM中递送治疗剂的原理提供了证据。

　　用于治疗脑肿瘤的干细胞的起源

　　除了神经干细胞外，间充质干细胞和诱导的神经干细胞，来源于多能干细胞或体细胞的转分化，显示出向肿瘤的行为，并广泛分布于颅内胶质瘤。许多临床前试验已经测试了这些细胞在整个肿瘤中分布和递送多种治疗剂的能力:生物活性蛋白质、病毒、细胞因子、抗体、毒素或纳米颗粒。这些研究中的大部分测试了人类干细胞的使用，尽管一些使用了啮齿动物干细胞。较常用的是永生化的人神经干细胞，其次是来源于骨髓、脂肪组织、脐带或羊水的间充质干细胞，一项研究使用了来自成纤维细胞的转分化的间充质干细胞。啮齿类动物干细胞的应用也类似。有趣的是，除了一项关于人类神经干细胞的研究之外，全部的研究都使用了从胎儿大脑中获得的细胞v-myc癌基因。转导v-myc允许轻松、长期在试管内在血清存在下繁殖并阻止这些细胞的终末分化。

　　HB1。F3细胞系来源于妊娠15周的人类女性胎儿的端脑。细胞较初在添加了5%马血清的杜尔贝科改良Eagle培养基中的多聚赖氨酸包被的组织培养板上繁殖，并用编码复制不全的逆转录病毒载体转导v-myc。将成功转导的细胞以克隆密度铺板，并选择几个克隆，包括HB1。F3。HB1。F3细胞被转导表达胞嘧啶脱氨酶(CD)，生成HB1。F3.随后被广泛鉴定并被美国食品和药物管理局批准用于临床试验的镉细胞系。HB1。F3.CD细胞在含有10%胎牛血清的培养基中容易繁殖。早期实验表明HB1。F3细胞表达NES和ABCG2转运蛋白，暴露于5%牛血清后分化为表达神经丝(NF-L、NF-M和NF-H)的神经元、星形胶质细胞(表达GFAP)和少突胶质细胞(表达MBP)。使用的其他hNSC系是来源于妊娠10周胎儿中脑(ReNCell VM)或14周胎儿皮质(ReNCell CX)的ReNCell系，在补充有EGF和FGF的无血清确定的NSC培养基中在层粘连蛋白包被的平板上扩增[63].细胞也用逆转录病毒编码永生化v-myc(远程虚拟机)或原癌基因(CX)并且目前已经上市。神经细胞在生长因子撤退时分化为表达TUBB3的早期神经元，表达th的多巴胺能神经元，GFAP+表达GALC的星形胶质细胞和少突胶质细胞。尽管表达了真菌学癌基因，这些细胞在实验动物的大脑中或在临床试验中没有显示出产生肿瘤，并且它们中的大多数不会在大脑中持续存在。HB1的分化潜能。F3.较近没有测试CD线；尽管如此，它在GBM试验中被证明是顺利合适的。

　　用于治疗GBM的神经干细胞的主要功能是向肿瘤深处迁移并递送治疗剂。已经证明，来自小鼠和人中枢神经系统不同部分的神经干细胞具有不同的增殖和分化潜能，并表达对其来源区域特异的转录因子。然而，也有报道称，在培养时，表明神经干细胞位置同一性的许多转录因子的表达下调或丢失，这些变化改变了这些细胞的分化潜能。这种变化很可能也会影响用于GBM的神经干细胞的功能方面；在这个方向上严格的机制研究可能会导致提高治疗性神经干细胞效率的发现。

　　间充质干细胞是能够分化为来源于胚胎中胚层的组织的细胞，如脂肪组织、软骨、骨和肌肉。骨髓间充质干细胞可以在各种各样的组织中找到。治疗性MSCs来源于骨髓、脂肪组织、脐带血甚至胎盘，具有丰富、易分离和繁殖的优点；它们还具有很高的向肿瘤迁移的潜力，可以供体匹配。一些研究报告称，未经修饰的骨髓间充质干细胞可以促进其他癌症的肿瘤生长。然而，迄今为止，使用骨髓间充质干细胞治疗GBM的临床前研究尚未报告肿瘤形成。

　　与骨髓间充质干细胞相比，神经干细胞似乎更适合在整个脑肿瘤中分布和递送溶瘤病毒[70].HB1。在这个过程中，镉细胞比人细胞更合适。这种治疗优势的潜在机制至今尚未被探索。令人遗憾的是，作者没有具体说明所用的神经细胞是中脑源性的还是皮质源性的(神经细胞-VM或神经细胞-CX)。

　　iNSCs由体细胞通过特异性转录因子的瞬时表达而转分化产生，可来源于患者自身细胞，从而避免潜在的免疫反应，如使用同种异体NSCs时可能会遇到的情况。小鼠和人胰岛素样生长因子受体细胞都已被证明在GBM的临床前研究中是合适的。治疗性神经干细胞的主要顺利性问题是其诱导肿瘤形成的潜力，特别是当植入已建立肿瘤的患者的大脑中时，这些肿瘤产生允许肿瘤生长的微环境。在同基因小鼠模型中证明，iNSCs在这方面是顺利的，并且不诱导肿瘤形成，不像诱导性多能干细胞和胚胎干细胞那样产生侵袭性的致命肿瘤。iNSCs还没有在临床上进行过GBM测试。考虑到GBM的快速发展，人们担心这种方法是否允许及时和深入的质量和顺利性分析，以验证和扩大自体胰岛素样生长因子至治疗所需的必要数量，尽管这种努力有相关的成本。尽管如此，体细胞的转分化可能是药物递送的有力工具。如果在iNSCs中发现并设计促进较佳NSC迁移和肿瘤内分布的因素，并对其进行多方位的表征和测试，则可大大扩展NSC治疗工具箱。较近发表的一篇综述中描述了生成胰岛素样生长因子的详细策略。

　　为了临床应用和获得美国食品和药物管理局的批准，每个新建立的干细胞系都需按照良好的生产规范进行制备，并且需要根据良好临床规范的标准进行广泛的顺利性和治疗性测试。当不遵循严格的程序实践时——就像一些针对各种情况进行未经证实的干细胞干预的营利性诊所的情况一样——并且在缺乏监管的情况下(就像在一些国家遇到的情况一样),施用干细胞会导致并发症，包括肿瘤形成、栓塞、视力丧失、感染事件、自身免疫反应、中风、脑出血甚至死亡。

　　为了确保干细胞治疗的顺利性，确定干细胞一旦被输送后会发生什么至关重要。如上所述，早期的研究已经追踪了神经干细胞进入大脑后的命运，证明了它们分化为神经、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系的能力。用...永垂不朽的神经干细胞v-myc来源于人类或小鼠的，增殖良好在试管内但是一旦被移植到大脑中就停止了分裂，这可能是由于诱导分化的发育线索。HB1治疗患者的脑组织分析。F3.CD细胞还表明，在大脑中发现的神经干细胞没有增殖。不幸的是，较近的研究没有系统地分析分布在肿瘤动物大脑中的干细胞的表型。对于大多数采用的策略，治疗性干细胞参与了自杀任务，并在运送货物后死亡。

　　当使用被设计成分泌不影响其生存能力的细胞因子、抗体或毒素的细胞时，注射干细胞的命运更加相关。描述骨髓iNSCs命运的为数不多的研究之一表明，当这些BM-NSCs-IL-23细胞被注射到荷瘤小鼠的大脑中时，可以表达神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞特异性标记物(分别为TUBB3、GFAP和MYELIN),表明它们分化为各自的谱系。至关重要的是，未来的研究应更加严格和一致地解决治疗性干细胞的表型和命运，特别是在使用间充质干细胞时，间充质干细胞是一种定义相当松散的细胞群，以各种方式来源于不同的组织。缺乏标准化的方案和方法来表征治疗性干细胞可能会导致治疗失败，并降低对这一有前途的策略的信心。事实上，由于骨髓间充质干细胞能够促进和控制肿瘤生长，因此被称为“双刃剑”。越来越多的科学家指出，有必要完全描述这一异质细胞群体的特征，并为骨髓间充质干细胞的衍生和使用建立黄金标准——研究人员、临床医生和工业界共享的标准——以允许不同研究之间的适当比较和科学进步。

　　干细胞给药途径

　　基于干细胞的GBM治疗中的一个重要参数是给药途径，其需被设计成确保足够的细胞能够到达肿瘤并提供治疗益处。局部给药是所采用的优选方法，较常见的是在临床前(补充表1)和临床研究。脑室内给药也已被证明可导致干细胞良好的瘤内分布。对小鼠脑室给药后神经干细胞分布的定量分析和三维重建表明，即使是位于不同半球的多灶性肿瘤，这些细胞也能合适地向肿瘤迁移[83].神经干细胞倾向于位于肿瘤边缘，但也存在于肿瘤重要。一些细胞聚集在心室中，这被认为是由于注射的速度或细胞悬液过于浓缩[83].干细胞的脑室给药给这种治疗方式带来了几个优点，通过克服密集细胞环境的空间限制，允许剂量增加，通过放置微创脑室导管(一种常见的神经外科手术)重复给药，以及在脑脊液中给药的神经干细胞的生存能力可能增加。

　　在GBM小鼠模型中，已经系统地量化了静脉内或颅内给予越来越多的细胞后神经干细胞在肿瘤中的分布[84].如前所述，该分析显示，较高剂量的神经干细胞产生较好的肿瘤覆盖率，但仅达到一个点，之后肿瘤中实际存在的神经干细胞百分比随着颅内和静脉给药途径而下降。作者认为限速因素可能是肿瘤依赖性的或与给药技术有关；高密度的细胞可能导致聚集或存活率降低，从而限制肿瘤内的迁移和分布。还发现，较大的肿瘤吸引了更多的细胞，这可能是由于趋化肿瘤衍生的细胞因子。全身静脉给药需要比颅内注射多约10倍的神经干细胞才能达到相同的肿瘤覆盖程度，当治疗细胞数量有限或生产成本高时，需要仔细考虑这一要求。

　　干细胞局部给药进入大脑是侵入性的，重复给药可能导致并发症。治疗性干细胞非侵入性给药的一种有吸引力的替代途径是鼻内给药，这种方法利用了鼻粘膜的解剖和生理特性，允许沿着嗅觉或三叉神经并通过中枢神经系统内的血管周围途径进行运输，避免了BBB施加的运输限制和全身给药后治疗性细胞的清除。多年来，这种方法已在多项研究中建立并得到优化，在临床前脑肿瘤模型中显示出有希望的结果，尽管其疗效不如其他给药途径。

　　另一种新兴的输送干细胞治疗脑肿瘤的策略是动脉内途径。静脉注射干细胞的一个限制是大部分细胞滞留在肺部，降低了治疗效果。动脉内给药可以克服这一限制，特别是当使用血管内选择性动脉内技术，紧密靶向肿瘤部位时[91].载有卵巢颗粒并经颈动脉给药的间充质干细胞成功地用于GBM的临床前模型[92]并且目前正在使用条件复制溶瘤腺病毒Delta24-RGD(NCT03896568,补充表2).这种策略利用了骨髓间充质干细胞的肿瘤倾向性，这限制了病毒向其他器官的传播，也利用了骨髓间充质干细胞穿越血脑屏障并在肿瘤中广泛分布的能力。

　　治疗策略及其作用机制

　　一个使用干细胞治疗恶性神经胶质瘤的临床前研究出现在20年前，测试了四种不同的治疗策略:酶/前药OV，细胞因子疗法和促凋亡分子的递送。如今，这些机制仍在测试、优化、微调，并与其他治疗方式相结合，以克服局限性并提高疗效。使用装载OVs的神经干细胞或递送酶进行肿瘤内前药转化的试点/可行性和一阶段临床试验正在进行中。生物工程技术的较大进步开辟了令人兴奋的新治疗途径，产生了可与嗜神经胶质瘤干细胞结合用于药物输送的纳米粒子和纳米棒，以及靶向光热消融疗法。我们在以下章节中描述了这些研究，强调了实验进展、局限性和将这些策略转化为临床的努力。

　　酶/前药策略中的干细胞

　　用于癌症治疗的酶/前体药物策略长期以来一直致力于人为地对肿瘤细胞产生选择性和局部细胞毒性，而不伤害正常细胞[96].较广泛使用的组合是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)与更昔洛韦(GCV)和细菌CD与5-氟胞嘧啶(5-FC)。HSV-TK酶将GCV转化为GCV单磷酸，再被磷酸化为GCV三磷酸，这是一种有毒的抗代谢物，会错误地掺入到DNA中，导致分裂细胞死亡。缺乏单纯疱疹病毒-TK的细胞仍然可以通过一种被称为“旁观者效应”的现象作为凋亡的目标，这种现象需要活性药物通过间隙连接从邻近细胞中转运，从而增强细胞毒性反应。类似地，细菌酶CD能够将无毒的前药5-FC转化为强大的细胞毒性化合物5-氟尿嘧啶(5-FU)，其主要控制DNA复制所需的胸苷的产生，从而杀死暴露于其的分裂细胞。使用病毒载体的酶/前药基因治疗策略已经被广泛探索用于治疗GBM超过40年，但是仍然面临许多挑战，主要涉及病毒在肿瘤中的分布。神经干细胞的高度迁移能力及其在整个肿瘤和肿瘤卫星中分布的能力可能有助于好转这种治疗策略。

　　一个新兴的治疗GBM的令人兴奋的领域是基于干细胞通过外泌体递送蛋白质和核酸的能力。骨髓间充质干细胞和神经干细胞是已知的外泌体较多产的细胞类型。来自基因工程骨髓间充质干细胞的外泌体已被用于向神经胶质瘤细胞递送前药、微小核糖核酸或肿瘤控制剂在活生物体内和在试管内，证明治疗效果。用产生外泌体的改良干细胞治疗就地可以通过逃避肝和肾清除并允许外泌体在整个肿瘤中的好转归巢和分布来提供增强的功效。