【INC国际大咖研究成果】通过增强现实技术实现实时可视化的原位组织病理学分析

　　INC国际儿童脑瘤大咖、世界神经外科联合会(WFNS)执行委员会&顾问委员会成员之一的James T. Rutka教授发表研究《In situ tissue pathology from spatially encoded mass spectrometry classifiers visualized in real time through augmented reality》(通过增强现实技术实现实时可视化的原位组织病理学分析)，以下是研究简述。

　　01. 摘要

　　基于皮秒红外激光技术(PIRL-MS)的手持式质谱解吸探针与光学手术跟踪系统的集成，展示了通过点采样质谱数据进行的原位组织病理学分析。空间编码的病理分类结果以颜色编码像素的形式显示在激光采样的位置，并通过增强现实视频流实时呈现于手术视野中。这一功能通过定制接口实现了手术导航平台与质谱数据分析平台之间的双向通信。该系统性能通过小鼠癌症模型(模拟人类癌症)进行了评估，在存在体液的情况下，技术像素误差为1.0±0.2毫米，表明在不同分子模型中，乳腺、脑、头颈癌小鼠模型的细胞系分类准确率，分别为84%或92%(排除一个异常值)。此外，通过针对DNA损伤、细胞死亡和神经元活性的终点免疫组化染色验证，空间编码的PIRL-MS采样能够从活体小鼠脑组织中获取可分类的质谱数据，其神经元损伤程度与手术刀引起的损伤相当。这突出了空间编码PIRL-MS分析在神经外科手术中的潜在应用价值，例如用于癌症类型确定或在肿瘤床检查中进行活体组织定点采样以评估癌症切除情况。本文开发的用于分析和显示空间编码PIRL-MS数据的接口，可以适应目前可用的其他手持式质谱分析探针。

　　02. 材料与方法

　　GTxEyes和AMX的空间编码质谱整合。

　　PIRL探针与光学导航系统(NDI Polaris)和定制的3D可视化软件(GTxEyes)相结合，用于空间编码质谱分析。光学导航系统使用两个红外(IR)摄像机跟踪由四个被动红外反射球组成的IR传感器，该传感器附着在激光探针上。此外，还将一个四球IR传感器附着在Logitech C920 USB摄像头上，以空间关联跟踪探针位置与摄像机的位置关系。光学导航系统和定制软件此前已有描述，包括在锥形束计算机断层扫描(CBCT)引导的骨切开术、改善放射治疗中浅表病变勾画的定量内窥镜，以及CBCT与头颈部手术内窥镜的结合中的应用。GTxEyes定制软件实现了跟踪器械与成像模式(如CT、MR和光学成像)及参数信息(结合手术或放射治疗计划数据)的共同配准和实时可视化。该软件还对跟踪和校准的光学摄像机进行偏移校正，附着的IR球与摄像机的光学中心配准。

　　在本研究中，将上述光学导航系统的跟踪摄像机和Logitech C920摄像机放置在生物安全柜中，使Logitech C920能够看到激光探针，且激光探针和Logitech C920的IR传感器均在跟踪摄像机的可视范围内。通过光学导航系统跟踪的预校准指针确定激光探针尖端相对于附着IR传感器的位置，该指针通过“拾取”其烧灼点追踪到探针尖端以外的消融点，并通过虚拟指针模型模拟在激光束尖端远离组织表面处的消融过程。运行GTxEyes软件的笔记本电脑通过以太网连接连接到光学导航系统、Logitech C920摄像机和质谱数据采集与处理计算机。GTxEyes软件同时收集激光探针和Logitech C920摄像机的跟踪测量数据，进行反投影以确定相应的像素位置，并根据质谱分析计算机输出的分类结果对像素进行颜色编码。质谱图通过Waters AMX识别软件中的主成分分析线性判别分析(PCA-LDA)与预训练模型进行处理。

　　定制的GTxEyes软件集成了OpenIGTLink客户端，以轮询和流式传输AMX识别软件内置OpenIGTLink服务器的分类结果。每个分类帧包含一个组织分类ID和时间戳。然后在GTxEyes软件中创建颜色查找表，以匹配AMX识别中每个分类的标签颜色。颜色查找表将接收到的组织分类ID映射到RGB元组。对于跟踪的激光探针位置，通过Logitech C920摄像机的内在和外在参数(分别通过摄像机校准和光学导航系统确定)进行反投影，以确定像素坐标中的探针尖端位置。GTxEyes实时计算激光探针和Logitech C920摄像机每个IR传感器测量的像素位置。在从AMX识别接收分类输出帧后，GTxEyes软件根据查找表中的RGB值对Logitech C920视频帧的相应像素进行着色。

　　动物模型异种移植物的生成、PIRL-MS分析以及颅骨切开术和组织学分析的更多详细信息在ESI中提供。

　　03. 结论与讨论

　　图1.增强现实显示采样点组织病理的空间编码质谱结果。本图展示了(A)在采样点原位显示组织病理所需的空间编码质谱的组件，以及这些组件之间的相互作用。组织采样通过气溶胶化方法进行以产生质谱。然后将质谱数据与预先存在的多变量病理模型(或库)进行比较，并进行分类。在我们展示的应用中，采样是使用PIRL-MS进行的，多变量分析是使用AMX的PCA-LDA完成的。病理分类实时可用，并与从跟踪数据导入到实验室构建的“集成器”程序GTxEyes中的采样探针的位置信息(坐标)相结合。通过定制的链接将分类器从AMX传输到GTxEyes，从而实现数据导入。然后，利用软件中之前集成的采样视野摄像机馈送，GTxEyes软件可以实现实时显示彩色编码的病理信息。

　　(B)图A中系统组件的示意图及其相互作用。在适当的地方，我们已获得重用图形的许可。NDI Polaris跟踪摄像机监测探针位置以及提供采样事件实时视频馈送的Logitech跟踪摄像机的位置。质谱信号经过处理，并使用AMX进行多变量分析。所有组件向GTxEyes平台提供数据，该平台反过来将质谱分析的分子信息与定位数据整合，以增强现实的方式显示空间编码质谱分类器。在此，小鼠异种移植物的原位采样使得质谱的组织类型分类能够以假彩色显示在增强现实屏幕上。使用部分先前发布的图形文件，概念性地展示了空间编码质谱的输出显示(经皇家化学学会和美国癌症研究协会许可)。图形文件经过修改后在此处重现，说明了使用PIRL-MS和异种移植物组织的输出显示。

　　图2.空间编码PIRL-MS采样用于原位病理学确定，并实时显示结果。通过增强现实显示了基于质谱读数(PIRL-MS)的PCA-LDA建模的假彩色组织病理分类器，每个分类(即病理评估)在采样点(激光尖端)处以假彩色编码，并在摄像机馈送的采样视野中显示。该图提供了癌症边界评估应用(使用体外组织)和原位病理学(使用携带肿瘤的小鼠)的示例结果。

　　(A)通过将小鼠异种移植物髓母细胞瘤肿瘤块放置在正常小鼠脑组织旁边，创建了一个人工组织边界，用于评估空间编码PIRL-MS结果。PIRL-MS探针以连续的速度扫描并跨越组织边界(绿色轨迹)，每5秒对平均数据进行分类，使用先前数据建立的包含健康小鼠脑和Med8A癌症的两组分PCA-LDA模型。该分类显示在5秒采样周期结束时的空间编码位置，并在跨越边界时从健康组织变为癌症。实时视频显示了连续扫描和增强现实显示的分类结果，已作为ESI提供。

　　(B)使用携带肿瘤的小鼠验证原位病理学应用(总结在表1中)。在这里，髓母细胞瘤的Med8A和DAOY亚组的细胞被皮下双侧注射，形成了小的1 mm³和3.3 mm³肿瘤，用圆圈标记以指导读者找到它们的位置。这些亚组先前已被证明可以通过PIRL-MS进行分类，本研究中使用包含DAOY、Med8A和肌肉组织特征的三组分模型对它们进行空间编码PIRL-MS分类。在采样点(激光尖端)处得到了这些小肿瘤的预期假彩色空间编码分类结果。类似的方法也被用来评估表1中总结的其他癌症类型的表现，报告了良好的指标。

　　图3.使用小鼠模型在实际使用场景下评估PIRL-MS对神经组织的损伤。通过颅骨切开术使激光探针和手术刀能够接触脑组织。在麻醉状态下，使用PIRL-MS(n=8)采集质谱数据时进行表面“切口”，并使用手术刀(不采集质谱数据)进行切口。

　　(A)使用先前结果中新鲜或冷冻体外组织的混合物对小鼠器官数据进行PCA-LDA建模，显示在活体小鼠麻醉下获取的体内数据点按预期分类为器官类型，表明血液或体液的存在并未妨碍分类。

　　(B)实验设置：小鼠麻醉并固定在立体定位装置中，进行局部颅骨切开术，并应用PIRL探针或手术刀创建表面切口。

　　(C)组织病理学工作流程示意图。如实验部分所述，使用数字病理学通过TUNEL(DNA损伤)、Caspase-3(细胞死亡)和NeuN(神经元活性)染色阳性细胞量化损伤程度。每个组织切片在终点时被分为4个象限，如“分割”面板所示，利用脑组织的生物对称性，比较受损象限(激光探针或手术刀与脑组织接触处)与对照象限(未与激光或手术探针接触处)的探针损伤程度。对照象限的任何损伤均来自牺牲后从颅骨中提取脑组织的过程。如本面板所示，受损象限的探针损伤(箭头标记)是表面性的，并与颅骨切开术本身造成的损伤叠加。因此，报告并比较的激光和手术刀之间的所有损伤值均报告为“探针+颅骨切开术”损伤。报告对照象限值以说明敏感性。然而，面板(A)中呈现的PIRL-MS分类光谱表明，在实验条件下造成了一定程度的神经损伤。

　　图4.小鼠模型中激光诱导的神经组织损伤的组织病理学分析表明，PIRL与手术刀相比具有非劣效性。如正文所述，通过数字病理学方法对19只小鼠的76张组织病理学切片(激光组n=9.手术刀组n=10)进行分析，评估了DNA损伤(TUNEL染色)、细胞死亡(Caspase 3染色)和神经元活性(NeuN染色)。分别在24小时(评估即时神经损伤)和两周(评估长期损伤)两个时间点进行测量。每个柱状图中的对照测量值指的是根据图3C所示示意图中对照象限的染色阳性细胞测量值。误差条表示均值的标准误差。即使在对照组和实验组测量值未见显著差异的情况下，组织病理学切片的目视检查表明受损象限可能有部分物质缺失(见图3C)。考虑到“缺失”的物质可能包含一些受损细胞，这些细胞不会出现在分析中，从而引入偏差，我们确认小鼠在PIRL-MS采样后存活。星号表示与对照组相比，每个队列中统计学上显著的测量值。除了Caspase 3染色外，其他情况下对照组和实验组测量值之间观察到统计学上显著的差异。然而，激光和手术刀之间的损伤程度并无差异，表明PIRL具有非劣效性。这一观察结果在三种染色中均成立。激光和手术刀(主要由于颅骨切开术本身的侵入性)引起的即时DNA损伤(TUNEL染色)在两周内大多恢复(图S4)。为了比较激光和手术刀的损伤，在24小时和两周时对激光和手术刀损伤区域进行了双样本t检验(假设方差不等，α=0.05)。与两周手术刀损伤组相比，两周激光损伤组的TUNEL染色显著减少(p=0.035)。在所有其他情况下，差异均不显著。因此，我们的测试表明，PIRL-MS采样在神经组织损伤方面与手术刀相比具有非劣效性。